土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法.docx
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土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法
土壤酶活性测定
取样工具及取样方法
在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时刻、地点、环境条件等,以备查考。
土样在自然条件下烘干装入袋中备用。
所需试剂:
酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、
配置方法:
铵态氮标准溶液:
称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中,再加水稀释至1000mL,此溶液1mL含100µgN。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度,制备成的溶液在490nm下比色,并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液:
PH5.0,NaAc.3H2O50g,溶于适量水中,加6mol/LHAc34ml,稀释至500ml。
硼酸缓冲液:
PH9.0,80毫升0.05mol/l硼砂(Na2B4O7.10H2O)和0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂:
将碘化钾10g溶于10ml水中,边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液,直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之,再加入氯化汞饱和溶液1ml,加水至200ml。
静置,取上层清液,贮于棕色瓶中
酚的标准溶液:
(1)原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升,溶液在暗色中稳固,
(2)工作液—取50ml原液稀释至1升(1ml含0.05mg酚);分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容(分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚),待颜色稳固后,570nm比色绘制标准曲线。
测定方法
磷酸酶活性测定
试验原理
土壤中的磷,专门大部分以有机磷化合物的形式存在。
磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。
实验表明,土壤微生物关于土壤含磷有机物质的矿化起着要紧作用;土壤的磷酸酶活性,在专门大程度上取决于土壤的腐殖质含量,活性磷量,能矿化有机磷化合物的微生物数量,植物类型等因素,土壤的磷酸酶活性能够表征土壤的肥力状况。
实验仪器
恒温箱、分光光度计、
实验药品
甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、
实验步骤
取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中,用0.8(16滴)毫升甲苯处理,15分钟后,加入5毫升苯磷酸二钠溶液(6.75克苯磷酸二钠溶于水,并稀释至1升)和5毫升相应的缓冲液(碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液,中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液,酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液)。
认真混合后,将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时,然后用蒸馏水定容至刻度,摇匀过滤,用5毫升水代替基质以设置对比。
为了测定反应混合物中的酚量,取1毫升滤液于100毫升容量瓶中,加5毫升硼酸缓冲液(pH9.0),再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉,摇动,溶液呈粉红色,然后再加水定容,待颜色褪到稳固时(约需20~30分钟),在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度,按照用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。
磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示。
脲酶活性测定
试验原理
土壤的脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正有关。
根基土壤可测得最大的脲酶活性,人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。
实验仪器
锥形瓶、定性滤纸、震荡器、分光光度计、1mm筛、
实验药品
酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、铵态氮标准溶液、双蒸水
实验步骤
准确称取10.00g过1mm筛的风干土样,置于150mL锥形瓶中,注入50mL20%的NaCl溶液,将瓶塞紧,在振荡30min(120r/min)后,用定性滤纸过滤。
取20mL滤液于50mL容量瓶中,加双蒸水稀释至40mL左右,加2mL25%酒石酸钠,充分摇动静置5min,使其与Cd,Mg离子络合;
再加入10滴1%阿拉伯胶,摇动后加2mL纳氏试剂,边加边摇,定容至刻度,5min后用490nm比色,配制铵态氮标准溶液,绘制标准曲线,比色后求算土壤脲酶活性。
结果分析
滴定法测定过氧化氢酶活性
试验原理
土壤的过氧化物酶活性,与土壤的呼吸强度和土壤微生物活动有关,在一定程度上反映土壤微生物过程的强度。
根际土壤的过氧化物酶活性,远较根际外土壤为高。
有机质含量高的土壤,过氧化氢酶活性较强。
因此,土壤过氧化物酶的活性能够表征土壤总的生物学活性和肥力状况。
本试验采纳滴定法测定过氧化氢酶活性,即通过定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量。
实验仪器
致密滤纸、酸式滴定管、1mm筛
实验药品
双蒸馏水、H2SO4、过氧化氢、KMnO4、
实验步骤
准确称取5.00g过1mm筛的风干土样,置于150mL锥形瓶中,注入40mL双蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢,另设对比,塞紧瓶盖,振荡30min(120r/min)后,注入5mL1.5mol/LH2SO4终止反应,用致密滤纸过滤,取滤液25mL,用0.1mol/LKMnO4滴定至微红色。
土壤的过氧化氢酶活性,用100g土重的0.1mol/LKMnO4毫升数表示。
土壤微生物检测
一、取样工具
无菌刮铲、土样采集器、镊子、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。
二、采土方式:
在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时刻、地点、环境条件等,以备查考。
为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品赶忙进行处理或放在4℃冰箱中暂存。
三、所需培养基及配置方法
1、牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)
牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂15~20g,水1000ml,pH7.0~7.2,121℃灭菌20min。
2、高氏(Gause)1号培养基(培养放线菌用)
可溶性淀粉20g,KNO31g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO4 .7H2O0.5g,FeSO4 0.01g,琼脂20g,水 1000ml,pH7.2~7.4。
配制时,先用少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中,在火上加热,边搅拌边加入其它成分,溶化后,补足水分至1000ml。
121℃灭菌20min。
3、无氮培养基(自身固氮菌、钾细菌)
甘露醇(或葡萄糖)10g,KH2PO40.2g,MgSO4·7H2O0.2g,NaCl0.2g,CaSO4·2H2O0.2g,CaCO35g,蒸馏水1000ml,pH7.0~7.2,113℃灭菌30min。
4、马丁氏(Martin)琼脂培养基(分离真菌用)
葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O0.5g,1/3000孟加拉红(rosebengal,玫瑰红水溶液)100ml,琼脂15~20g,pH自然,蒸馏水800ml,121度灭菌30min。
临用前加入0.03%链霉稀释液10ml,使每毫升培养基中含链霉素30µg。
蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨5克、KH2PO40.5g,NaCl0.25g,琼脂18克,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO40.01克,水1000毫升,pH7.2,一气压灭菌20分钟灭菌。
四、所需药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4 、 甘露醇(或葡萄糖)、CaSO4·2H2O、CaCO3、孟加拉红、链霉素
五、检测方法
土壤中放线菌的检测
试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测放线菌
实验仪器及试剂
7个土样,3个重复,共需252个灭菌培养皿;灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶
高氏一号培养基
可溶性淀粉20g,KNO31g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO4 0.5g,FeSO4 0.01g,琼脂20g,水 1000ml,pH7.2~7.4。
配制时,先用少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中,在火上加热,边搅拌边加入其它成分,溶化后,补足水分至1000ml。
121℃灭菌20min。
实验步骤
在超净工作台中,无菌称取所取土样10g,分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中,于摇床震荡30分钟。
用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中,此即为10-2稀释的土壤悬液。
如此操作,一直到10-10。
稀释。
(另外,要明白所称土样的含水量)
倒人45℃恒温水浴的灭菌高氏l号培养基,水平放置,凝固待用;分别无菌吸取各样品10-4、10-5、10-6、10-7稀释液,加入灭菌平皿中(每稀释度3皿,每皿lml),用玻璃涂布棒涂抹平均,将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
放线菌的培养时刻较长,故制平板的培养基用量可适当增多
培养48h后,取出培养平皿,选出土样适合菌落计数的稀释度,算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数(选择平均菌落数在30-300之间的),并按下列公式进行运算,最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
土壤中细菌的检测
试验原理
应用稀释平板法从土壤中分离细菌
实验仪器及试剂
7个土样,3个重复,共需252个灭菌培养皿;灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶
牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5g,琼脂15~20g,水1000ml,pH7.0~7.2,121℃灭菌20min。
实验步骤
在超净工作台中,无菌称取所取土样10g,分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中,于摇床震荡30分钟。
用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中,此即为10-2稀释的土壤悬液。
如此操作,一直到10-10。
稀释。
(另外,要明白所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液,加入灭菌平皿中(每稀释度3皿,每皿lml),倒人45℃恒温水浴的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基,混匀。
(稀释倍数是情形而定)
3、待培养基凝固后,将平皿倒置于37℃恒温培养箱中培养。
4、培养24h后,取出培养平皿,选出土样适合菌落计数的稀释度,算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数(选择平均菌落数在30-300之间的),并按下列公式进行运算,最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
土壤中真菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测真菌
二、实验仪器及试剂
7个土样,3个重复,共需252个灭菌培养皿;灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
马丁氏(Martin)琼脂培养基(分离真菌用)
葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O0.5g,1/3000孟加拉红(rosebengal,玫瑰红水溶液)100ml,琼脂15~20g,pH自然,蒸馏水800ml,121度灭菌30min。
临用前加入0.03%链霉稀释液10ml,使每毫升培养基中含链霉素30µg。
(链霉素在培养基融解并冷却至50摄氏度时加入,用剩的链霉素在冰箱可储存4个月,但每过一月,在1升培养基中需多加0.1ml)。
三、实验步骤
1、在超净工作台中,无菌称取所取土样10g,分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中,于摇床震荡30分钟。
用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中,此即为10-2稀释的土壤悬液。
如此操作,一直到10-10。
稀释。
(另外,要明白所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-2、10-3、10-4、10-5稀释液,加入灭菌平皿中(每稀释度3皿,每皿lml),倒人45℃恒温水浴的灭菌马丁氏(Martin)琼脂培养基,混匀。
(稀释倍数是情形而定)
3、待培养基凝固后,将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h后,取出培养平皿,选出土样适合菌落计数的稀释度,算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数(选择平均菌落数在30-300之间的),并按下列公式进行运算,最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
土壤中自身固氮菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。
二、实验仪器及试剂
7个土样,3个重复,共需252个灭菌培养皿;灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
无氮培养基
甘露醇(或葡萄糖)10g,KH2PO40.2g,MgSO4·7H2O0.2g,NaCl0.2g,CaSO4·2H2O5g,CaCO31000ml,蒸馏水1000ml,pH7.0~7.2,113℃灭菌30min。
三、实验步骤
1、在超净工作台中,无菌称取所取土样10g,分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中,于摇床震荡30分钟。
用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中,此即为10-2稀释的土壤悬液。
如此操作,一直到10-10。
稀释。
(另外,要明白所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液,加入灭菌平皿中(每稀释度3皿,每皿lml),倒人45℃恒温水浴的灭菌无氮培养基,混匀。
(稀释倍数视情形而定)
3、待培养基凝固后,将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h后,取出培养平皿,选出土样适合菌落计数的稀释度,算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数(选择平均菌落数在30-300之间的),并按下列公式进行运算,最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
土壤中氨化细菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。
二、实验仪器及试剂
7个土样,3个重复,共需252个灭菌培养皿;灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨5克、KH2PO40.5g,NaCl0.25g,琼脂18克,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO40.01克,水1000毫升,pH7.2,一气压灭菌20分钟灭菌。
三、实验步骤
1、在超净工作台中,无菌称取所取土样10g,分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中,于摇床震荡30分钟。
用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中,此即为10-2稀释的土壤悬液。
如此操作,一直到10-10。
稀释。
(另外,要明白所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-6、10-7、10-8、10-9稀释液,加入灭菌平皿中(每稀释度3皿,每皿lml),倒人45℃恒温水浴的灭菌蛋白胨琼脂培养基,混匀。
(稀释倍数视情形而定)
3、待培养基凝固后,将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h-72h后,取出培养平皿,选出土样适合菌落计数的稀释度,算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数(选择平均菌落数在30-300之间的),并按下列公式进行运算,最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
试剂购买
序号
试剂名称
规格
需要数量(单位:
瓶)
实验室现有药品
备注
1
牛肉膏
500g/瓶
1瓶
有
未专门注明,所用化学试剂均为分析纯
2
蛋白胨
500g/瓶
2瓶
3
琼脂
500g/瓶
4
4
可溶性淀粉
500g/瓶
2
5
葡萄糖
500g/瓶
3
6
氯化钠
500g/瓶
1
有
7
硝酸钾
100g
1
有
8
磷酸氢二钾
500g
1
有
9
7水硫酸镁
500g/瓶
1
有
10
硫酸亚铁
500g/瓶
1
有
11
2水硫酸钙
500g/瓶
1
有
12
碳酸钙
250g/瓶
1
有
13
14
孟加拉红
最小包装
15
链霉素
25g/瓶
1
16
酒石酸钠
100g/瓶
1
17
阿拉伯胶
100g/瓶
1
18
碘化钾
50g/瓶
1
有
19
氯化汞
50g/瓶
1
20
氢氧化钾
500g/瓶
1
21
硫酸铵
500g/瓶
1
22
甲苯
200ml左右
23
苯磷酸二钠
10g左右
24
NaAc.3H2O
500g/瓶
1
25
乙酸
500ml/瓶
1
有
26
酚
100g/瓶
1
有
27
铁氰化钾
100g/瓶
1
28
4-氨基安替吡啉
25g/瓶
1
29
硼酸
500ml/瓶
1
有
30
硼砂
500g/瓶
1
31
三氯乙酸
500g/瓶
1
32
硫代巴比妥酸(TBA)
最小包装
33
丙酮
500ml/瓶
1
有
34
氮蓝四唑
100mg/瓶
1
35
36
- 配套讲稿:
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