革兰氏染色的机理和步骤.docx

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革兰氏染色的机理和步骤

机理：

G+G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。

主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。

G+勺CWM聚糖层厚，脂质含量低。

乙醇脱色时CW兑水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。

G-的CW肽聚糖层薄，脂质含量高。

乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。

步骤：

①涂片：

在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。

2固定：

将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。

3初染：

用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。

4媒染：

以碘液媒染1min,水洗，吸干水分。

（细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用）

5脱色（关键步骤）：

以95%勺乙醇脱色30s,应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。

6水洗，吸干。

7复染：

？

?

（第2张）复染30s,水洗吸干。

8干燥镜检。

2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。

芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差,以及皮层的离子强度很高,这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分,其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水,正是这种失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。

3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够

维持微培PH稳定。

答：

培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，

会导致PH变化。

（第2张中的图）

还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N低,经培养基后PH明显上升。

PH调节：

①加入缓冲剂常用：

一氢二氢磷酸盐，K2HP®呈碱

性，KHPO酸性，只在一定的PH范围内调节（）

2大量产酸的菌株，加CaCO调节，CaCO难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。

3培养液中存在天然的缓冲系统，如AA肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。

4过酸：

治标------加NaOHNcPCQ中和，治本-----加适量氮源：

NaNO3Pr、NH3-H2O增加通风量。

5过碱：

治标-----H2SO43HCl中和，治本----加适量碳源:

G类，脂类;减小通风量。

3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？

抗生素法（青霉素法）：

适用于细菌。

原理：

青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的cvy野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B在基本培养基上休眠状态存活下来，从而达到浓缩营缺型目的。

制霉菌素法适用于真菌，其可与

cm上？

（第1张）醇作用，引起cm损伤，因为它只能杀死生长繁殖着的真菌，所以

菌丝过滤法:

基本培上，野生型霉菌，？

菌的孢子能萌发并长成菌丝，而缺型孢子一般不萌发，或不能长成菌丝，因此培养一段时间后，用灭菌脱脂棉或滤纸滤去菌丝，收集滤液，重复数遍后可除去大部分野生型，从而……

4、生产蛋白酶的枯草芽孢杆菌发生遗传变异，使得产量性状下降，你如何解决？

写出具体实验方案。

答：

将一定量的枯草芽孢杆菌培养液，做一定浓度的稀释，涂布在含有酪素蛋白质的基本培养基上，37°C培养一段时间后，取出培养基,观察单菌落形成的透明圈大小，取透明圈直径与菌落直径之比较大的菌落，挑取培养做进一步的鉴定，即可得到高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌。

5、以磺胺为例，说明化学治疗机的作用机制。

答：

机理:

磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，（磺胺类药物取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢紊乱，从而抑制B生长），磺胺的抑菌作用是因为许多细菌需要自己合成叶酸而生长，磺胺对人体细胞无毒性，因为人体缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶二氢叶酸合成酶，不能用外界提供

的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。

（磺胺类与正常代谢产物竞争酶的活性中心，干扰了酶的

功能，从而干扰代谢的正常进行）。

6、画出生长曲线。

（第1张）

1、微生物的共性？

哪个最基本？

答：

①体积小，面积大（最基本）②吸收多，转化快③生长旺，繁殖

快思适应性强，易变异⑤分布广，种类多。

2、比较G+G-B在CW吉构，组成，对溶菌酶，青霉素的敏感性4方面的异同点。

结构

成分

对溶菌酶

青霉素

G+

单层，组分

简单，厚

肽聚糖（90%磷壁

酸（10%

敏感

生长期的G+

对其敏感

G-

多层，组分

复杂，薄

内壁层：

肽聚糖外膜：

脂多糖，磷脂，脂蛋白

敏感

不敏感

3、表型延迟现象？

如何克服？

答：

表型延迟：

表型的改变落后于？

（第四张）改变的现象，分为

①分离性延迟；突变的？

经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。

②生理性延迟；杂合状态t纯合状态，仍不能表现出来，（如营缺型）通过中间培养（CM培养过夜），可使突变？

稳定下来，克服表型延迟。

4、培养B常用的斜面培养基是什么？

简述配制程序。

答：

牛肉膏蛋白胨培养基

①称量；按配方依次准确称量②融化：

取少量水于烧杯中，加1%的蛋

白胨，加热溶解，加%的牛肉膏，加热溶解，加%的NaCl,热熔，加水

补充到所需体积。

③调PH至左右。

④加琼脂固体2%热熔。

⑤分装入试管，加塞，包扎，高压灭菌⑥搁置斜面（斜面长度不超过试管一半）⑦无菌检查：

将灭菌的培养基放入37°C的温室中培养

24-28h，以检查灭菌是否彻底。

5、啤酒酵母在分批发酵中的生长曲线分哪几个时期？

在菌种扩培时，哪个时期做种子？

为什么？

答：

延滞期，对数生长期，稳定期，衰退期。

对数期做种子。

利于缩短延滞期。

6、菌种衰退的根本原因？

防治措施？

答：

？

的自发突变。

措施：

①减少传代次数②创造良好的培养条件③采用不易衰退的菌种传代④采取良好的菌种保藏措施

4、菌种衰退的根本原因，防止措施。

如何区分衰退和饰变？

答：

根本原因：

？

的自发突变。

（②传代次数的影响，是负突变株比例占优势，③培养条件）

防止措施见上题。

区分：

衰退：

指随着菌体的不断生长，负突变菌株的数量占整个菌体数量的比例增大，最终导致菌株的生产性能大幅下降的现象。

①原有形态性状不典型，②生长速率下降③代谢产物生产力下降④对宿主侵袭力下降⑤抵抗力下降

饰变:

遗传物质结构不发生变化，而只在转录与转译水平上的表型变化，可以同一条件继续培养，观察子代的情况。

饰变特点：

暂时性，不可遗传性，表现为全部个体的行为。

变异：

遗传性，群体中极少数个体的行为。

5、gone?

突变的特点？

答：

①自发性②非对应性③稀有性（突变率10-6~10-9）④独立性⑤可诱发性（升高10~10A5倍）⑥稳定性⑦可逆性（原养型＜=＞突变型）

6、v（第三张）的特点。

答：

①形体微小，能通过细胞滤器（），电子显微镜下才能看见②不具有细胞机构，主要成分NAPr③V只含有一种核酸，DNA或RN④无核糖体，即无产能酶系，也无Pr,NA合成酶系，专性活细胞内寄生⑤无个体生长，也不进行二分裂，以NA,Pr等“元件”装配，实现大量繁殖。

⑥离体下以无生命的生物大分子状态存在⑦对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。

7、？

月元病毒的致病机理。

答：

月元病毒是一种Pr侵染颗粒，仅有Pr组成，称作PrP。

细胞型PrPPrPAc对蛋白酶敏感，无凝聚能力，而致病型

PrP---PrPAsc对蛋白酶有一定抗性，可凝集成纤维状组织，PrPAsc进入细胞后，与PrPAc结合，形成PrPAsc---PrPAc复合体，PrPAc构型发生改变，转化成PrPAsc，PrPAsc数量呈指数增加，其潜伏期长，对中枢神经损害严重。

估菌计数法及其特点（笔记P31）

乳糖操纵子（P30）

1、

营养价值

融化温度「C）

凝固温度「C）

常用C（%）

琼脂

无

96

40

明胶

氮源

35

20

5~12

2、伴孢晶体？

它在何种B中产生？

答：

伴孢晶体：

苏云金芽孢杆菌等少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体（3肉毒素）称

为伴孢晶体。

对约200种昆虫无为鳞翅目幼虫有毒杀作用，可制成B杀虫剂。

3、霉菌菌落的特征？

答：

①质地疏松，呈絮状，网状，绒毛状，地毯状。

②形态大，分为局限性生长（青、曲）和蔓延性生长（根毛）③菌落干燥（孢子）④颜色丰富，正反颜色常不一致，中心与边缘常不一致。

⑤各种霉菌，在一定培养基上，形成的菌落大小，形状，颜色相对稳定，为分类依据之一。

4、利用磷酸盐或碳酸钙如何维持PH稳定性？

答：

①磷酸氢二钾略呈碱性，磷酸氢二钾略呈酸性，两物质以等摩尔

浓度溶液PH为，其缓冲能力一般在~范围内有效。

磷酸氢二钾+H阳离子---->磷酸氢二钾+K阳离子

磷酸二氢钾+K阳离子+OH-t磷酸氢二钾+H2O

②大量产酸的菌株，加入碳酸钙调节，碳酸钙难溶于水，不会使培养基PH过度升高，但可不断中和微生物产的酸，同时放出二氧化碳，而降培养基PH控制在一定范围。

5、单倍体酵母细胞经?

?

（第5张）诱变后，得到一系列的突变株，欲从中分离筛选出一株（Leu-）,请设计合理的试验程序。

答：

淘汰型野生型-（制霉菌素法）-检出-鉴定（滤纸片法）将单倍体酵母细胞突变株，制成菌悬液，均匀涂布于完全培养基上，长成单个菌落之后，以逐个检出的方式接种于完全培养基上，并影印到基本培养基上，在适宜条件下培养一段时间，在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的，即为营养缺陷型菌株。

将此菌株检出离心，水洗之后制成适当浓度的菌悬液，与基本培养基均匀混合后，倾注于平板中，干燥凝固之后，在板上划分几个区，在区中加入蘸有色AA的滤纸片，经培养后，在纸片周围有浑浊的生长圈的，说明为色AA营养缺陷株。

6、MR,.实验的原理。

答:

MR用来检测由G产生的有机酸，如甲酸，乙酸，孚L酸等，细菌代谢糖产酸，PH降低，甲基红指示剂由橙色（PH=变成红色（PH=大肠杆菌---阳性：

利用孚糖产生孚酸，培养后PH<大肠杆菌---阴性：

早起产有机酸，后转化有机酸-乙醇，丙酮酸。

②.用来测定细菌利用G产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。

丙酮酸经缩合-乙酰甲基甲醇（经碱性、氧化）-二乙酰。

二乙酰与蛋白胨中精AA中胍基作用，生成红色化合物，产气肠杆菌---阳性，大肠杆菌---阴性。

7、什么叫生长曲线？

单细胞微生物的典型生长曲线分几期？

划分依据？

答：

生长曲线：

将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得到一条反应在整个培养期间菌数变化规律的曲线。

分为延滞期，对数期，稳定期，衰亡期。

根据生长速率常数划分，即单位时间内分裂次数的不同。

8、为什么诱变时，要制成充分分散的单细胞或单孢子悬液？

对放线菌进行诱变育种时，宜处理其孢子还是菌丝细胞？

为什么？

答：

使每个细胞均匀接触诱变剂，减少表型延迟现象，并避免长出不纯菌落。

多使用单核无性孢子，由于孢子生理上处于休眠状态，单核区基中了大部分的DNA减少分离表型延迟，提高突变效果。

培养基原则：

①目的明确②适宜的营养物质③浓度及配比合适④控制

PH条件⑤控制氧化还原电位⑥原料来源经济节约⑦灭菌处理

1、青霉素的作用机制？

答：

原理：

B-内酰胺环的结构与肽聚糖单体五肽尾末端的

D-Ala-D-Ala二肽结构相近，因而可竞争性的抑制转肽酶的活性，抑

制单体间