流式细胞仪数据分析.docx

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流式细胞仪数据分析

流式细胞仪数据分析

工作条件:

1.1电源要求:

220V（?

10%）、50HZ（?

10%）

1.2环境温度:

5-35?

1.3在相应湿度10-80%的环镜下工作

2.设备用途:

细胞分析和分选功能

2.1分析功能:

2.1.1细胞周期测定，DNA含量分析，RNA测量与分析

2.1.2细胞凋亡检测，

2.1.3蛋白质总量测定，

2.1.4生物活性的测定，

2.1.5细胞內钙离子流动试验，Ca2+浓度测定，细胞内pH值测量，

2.1.6细胞內OxidativeBurst代谢产物，细胞表面电荷检测。

2.1.7抗原特异性免疫细胞的检测、分选和细胞治疗技术

2.1.8检测细胞因子，可溶性荧光蛋白等

*2.2细胞分选

流式一体化分选功能，采用捕获管技术，分选速度300个细胞/秒，分选纯度98%

3.技术规格:

3.1主机系统

*3.1.1流式细胞仪主机系统:

含15mw488nm氩离子蓝色激光器，635nm红色激光器，4个荧光探测器和2个散射光探测器

*3.1.2光路:

双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析:

488nm激光器激发的三色荧光,635nm激光器激发第四色荧光.采用测向光路设计

*3.1.3滤光片:

488nm激光的荧光通道包括530/30nm、585/42nm、670nmLP;635nm激光的荧光通道:

661nmLP

*3.1.4可选用荧光:

FITC,PE,PerCP,PI,PE-Cy5,PerCP-Cy5.5,PE-Cy，APC,Rhodamine,

Cyanine等*3.1.5必须配流式一体化分选系统

3.1.6光电倍增管:

光谱检测范围300nm-1100nm电压150V-990V

3.1.7荧光检测灵敏度:

<100MESF

3.1.8全峰宽变异系数:

CV<2%

3.1.9样本获取速度:

>10，000个细胞/秒

3.1.10检测颗粒大小:

0.1um（min）-50um（max）

3.1.11最少样本体积:

100μl

3.1.12流动室孔径:

430umX180um

3.1.13自动抽吸系统:

换样时自动吸去管道内剩余样本，避免样本之间的相互干扰

*3.1.14脉冲处理系统:

能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,用脉冲宽度和面积区分双连体细胞（如假四倍体细胞）

3.2数据处理系统

苹果MACPro工作站

3.2.1CPU:

双核，主频2.8G

3.2.2内存:

2G

3.2.3硬盘:

容量300G

3.2.4独立显卡

3.2.5光驱:

DVD-ROM,CD-RW

3.2.6显示器:

19英寸液晶显示器

3.3应用软件

3.3.1全自动仪器校正软件

3.3.2多功能流式应用软件

3.3.3DNA分析软件

4（资料

4.1有仪器全套电路图及中文操作手册

4.2有中华人民共和国医疗器械注册证

工作条件:

1.1电源要求:

220V（?

10%）、50HZ（?

10%）

1.2环境温度:

5-35?

1.3在相应湿度10-80%的环镜下工作

2.设备用途:

细胞分析和分选功能

2.1分析功能:

2.1.1细胞周期测定，DNA含量分析，RNA测量与分析

2.1.2细胞凋亡检测，

2.1.3蛋白质总量测定，

2.1.4生物活性的测定，

2.1.5细胞內钙离子流动试验，Ca2+浓度测定，细胞内pH值测量，

2.1.6细胞內OxidativeBurst代谢产物，细胞表面电荷检测。

2.1.7抗原特异性免疫细胞的检测、分选和细胞治疗技术

2.1.8检测细胞因子，可溶性荧光蛋白等

*2.2细胞分选

流式一体化分选功能，采用捕获管技术，分选速度300个细胞/秒，分选纯度98%

3.技术规格:

3.1主机系统

*3.1.1流式细胞仪主机系统:

含15mw488nm氩离子蓝色激光器，635nm红色激光器，4

个荧光探测器和2个散射光探测器

*3.1.2光路:

双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析:

488nm激光器激发的三色荧

光,635nm激光器激发第四色荧光.采用测向光路设计

*3.1.3滤光片:

488nm激光的荧光通道包括530/30nm、585/42nm、670nmLP;635nm激

光的荧光通道:

661nmLP

*3.1.4可选用荧光:

FITC,PE,PerCP,PI,PE-Cy5,PerCP-Cy5.5,PE-Cy，APC,Rhodamine,

Cyanine等*3.1.5必须配流式一体化分选系统

3.1.6光电倍增管:

光谱检测范围300nm-1100nm电压150V-990V

3.1.7荧光检测灵敏度:

<100MESF

3.1.8全峰宽变异系数:

CV<2%

3.1.9样本获取速度:

>10，000个细胞/秒

3.1.10检测颗粒大小:

0.1um（min）-50um（max）

3.1.11最少样本体积:

100μl

3.1.12流动室孔径:

430umX180um

3.1.13自动抽吸系统:

换样时自动吸去管道内剩余样本，避免样本之间的相互干扰

*3.1.14脉冲处理系统:

能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,用脉冲宽度和面积区分双连体细胞（如假四倍体细胞）

3.2数据处理系统

苹果MACPro工作站

3.2.1CPU:

双核，主频2.8G

3.2.2内存:

2G

3.2.3硬盘:

容量300G

3.2.4独立显卡

3.2.5光驱:

DVD-ROM,CD-RW

3.2.6显示器:

19英寸液晶显示器

3.3应用软件

3.3.1全自动仪器校正软件

3.3.2多功能流式应用软件

3.3.3DNA分析软件

4（资料

4.1有仪器全套电路图及中文操作手册

4.2有中华人民共和国医疗器械注册证

流式细胞仪数据分析

5.1数据采集及显示

光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。

流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。

根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件:

样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。

4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。

当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。

数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。

单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。

纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。

处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。

通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。

图5-1流式数据分析图

双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。

3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。

习题:

数据采集及显示

1在直方图中横轴和纵轴分别表示。

2二维点图用于显示

3在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。

5.2设门

通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。

如:

血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。

图5-2全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图

习题:

设门

1设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。

（对错）

5.3细胞亚群的数据分析

数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。

如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。

如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。

图5-3选定淋巴细胞亚群设门

门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。

在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。

我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。

单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。

如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。

直方图可直观单个参数的细胞数量。

阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。

左图中M1为阴性对照峰。

右图中M2为CD3FITC阳性峰。

图5-4阴性对照峰M1（NORM001）和CD3FITC阳性峰M2（NORM002）图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。

其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。

淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为:

M2:

2272/2891=78.59%。

图5-5直方图统计结果

二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。

图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。

左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19PE

），左下象限

（LR）为X轴阳性细胞（CD3FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。

图5-6阴性对照组（NORM001）和CD3FITC/CD19PE双染样本（NORM002）如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为:

296/2839=10.43%。

图5-7散点图统计结果另一个分析方法是划定区域，也就是设门。

我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）;然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。

在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为:

40/2866=1.40%。

图5-8CD3FITC/CD4PE双染样本分析图图5-9CD3FITC/CD4PE双染样本数据统计结果

这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。

为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（clusteranalysis）的新方法。

BD公司的MultiSETTM和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。

该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。

图5-10使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比

5.4流式细胞仪的其它应用以及数据分析

这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。

因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。

如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。

如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。

每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。

图5-11单细胞株分析图除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。

QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。

如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。

图5-12使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数我们使用ModFitLTTM软件进行DNA定量分析。

因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。

图5-13细胞周期的DNA直方图

习题:

数据分析

1二维点图和一维直方图的作用分别是什么,

2见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。

3LL象限代表双阳性细胞亚群。

（对错）

4见图5-6和图5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。

5只能使用矩形设定细胞区域范围。

（对错）

6使用区域设定法分析样本有哪些不足。

7避免细胞亚群移动的分析方法是什么。

8在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。

5.5CellQuest和CellQuestPro软件使用

CellQuest和CellQuestPro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。

它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。

现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuestPro时的强大功能及视觉质感。

CellQuest和CellQuestPro软件主安装在BDFACSCalibur型流式细胞仪上。

1（软件数据流程

在CellQuest和CellQuestPro软件的数据流分为二个部分:

方案和数据包。

方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。

可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。

每个采集方案分析样本后会生成数据包，

该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0。

CellQuest和CellQuestPro方案文件的图标

CellQuest和CellQuestPro数据文件的图标

CellQuest和CellQuestPro软件中还会有关于仪器设置的文件，保存

所有的实验条件。

它只能由CellQuest和CellQuestPro软件打开。

数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI。

2.软件与仪器的连接

流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。

1、先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。

2、在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuestPro软件。

3、从Aquire菜单下选择connettocytometer。

3（方案与数据之间的关系

CellQuest和CellQuestPro软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。

CellQuest和CellQuestPro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态:

Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。

当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒;

当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。

当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。

所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。

CellQuestProCellQuest4（方案的建立

A选择实验参数

默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用:

FS、SS、FL1、FL2、FL3。

当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm激光器。

B,

建立散点图或直方图，命名坐标

CellQuestPro软件主要工作界面，软件类似于Officeword的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。

使用工具条可以建立散点图、直方图并在图上设立各种门。

在CellQuestPro软件中，如果Inspector窗口开着

的话，选中任意直方图或散点图就会出现该图的属

性，其中包括有X、Y轴的参数、是否多色显示、

图的分析或采集属性等等。

在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。

建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。

在菜单上选择Acquire栏目，选择ParameterDescription，可出现关于文件存储和参数命名的对话框。

在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC，FL2为CD4PE……。

C,设门并建立门与图之间的关系

在工具栏上有左侧几个按钮可分别矩形门、自由门、

线性门、圆形门和自动门。

本处重点介绍Snap-To门，它可根据细胞

群体的分布自动调整门的形状适应细胞

群体。

R与G的关系

R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。

区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。

当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念:

Gate实际了个代数式，简称G，其运算式默认如下:

G1=R1，或G2=R2

当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1ANDR2。

此时G1就成了一个算术结果了。

G1=R1ANDR2

G2=R1NOTR2

G3=R1ORR2

RegionList管理门，可以重命名或删除门。

GateList是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。

建立门与图之间的关系

打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。

D，显示统计参数

选择任意直方图或散点图，在Stats下拉菜单下

会有更种统计参数选项。

对应于不同的图出现不

同的统计参数。

如何编辑这些统计参数

选择统计参数框，在Stats菜单下的EditStatistic

会变得可用，点出后出现统计参数编辑对话框。

5（仪器的操作

当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框:

在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框:

6（文件的保存及调用

实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文件:

如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可;方案可以分析以往的数据包（前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性），有两种方案打开以往的数据:

方法一:

选择直方图或散点图，打开该图的属性框（Plot->>Format），见下图:

在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。

方法二:

选中方案中所有的直方图或散点图，打开Plots菜单，选择ChangDataFile，打

开要分析的数据包。

附:

CellQuestPro软件所有下接菜单