汉回蒙古族MBL 基因Exon I 54位密码子点突变频率及血浆含量相关性研究.docx
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汉回蒙古族MBL 基因Exon I 54位密码子点突变频率及血浆含量相关性研究.docx
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汉回蒙古族MBL基因ExonI54位密码子点突变频率及血浆含量相关性研究
汉、回、蒙古族MBL基因ExonI54位密码子点突变频率及血浆含量相关性研究
【摘要】目的:
初步调查我国北方地区汉、回、蒙古族健康人群MBL基因ExonⅠ54位密码子点突变的情况,检测其血浆MBL含量,探讨二者的相关性。
方法:
用PCRRFLP检测MBL基因点突变频率;用MBLOligomerELISA试剂盒测定血浆MBL含量。
结果:
健康汉族人该基因突变频率,血浆MBL含量均值±/L,二者负相关;回族人突变频率,MBL含量均值±/L,二者负相关;蒙古族人基因突变频率,含量均值±/L,二者负相关。
结论:
健康汉、回、蒙古族人MBL基因54位密码子点突变频率与其血浆含量均呈负相关。
【关键词】汉族;回族;蒙古族;基因顺序
【ABSTRACT】Objective:
Tostudyandanalyzethepointmutationatcode54inhealthyNorthHan,HuiandMongoliapeople,measuretheplasmalevelsofMBL,andanalyzetheassociationbetweengenemutationfrquenciesandplasmaMBL:
PCRRFLPwasusedtodetectMBLpointmutation;TheMBLplasmaconcentrationsweremeasuredbyMBLOligerELISA:
Frequenciesofpointmutationatcode54ofMBLcodinggeneinhealthyHan,HuiandMongoliapeoplewere,,plasmaMBLconcentrationswere±/L,±/Land±/wasnegtivecorrelationbetweenMBLconcentrationsandgenemutationfrequenciesinHan,HuisandMongoliapeople(r=-,r=-,r=-).Conclusion:
Therelationshipbetweenmutationfrequencyatcode54ofMBLgeneandtheplasmaMBLconcentrationsinNorthHan,HuisandMongoliapeopleisnegativecorrelation.
【KEYWORDS】Hanrace,Huirace,Mongolia,Geneorder
甘露聚糖结合凝集素是一种血清C型凝集素,通过糖基识别区选择识别病原生物,如细菌、病毒、寄生虫以及一些恶性肿瘤细胞等膜上特有的糖类结构,起调理素作用,还可通过MBL途径激活补体,在免疫监视和免疫防御中具有非常重要意义[1]。
近年来的研究表明,MBL的基因突变频率极高,是血浆MBL水平低下的根本原因,而MBL缺损可引起机体调理吞噬功能低下,从而导致各种病原体反复感染、自身免疫性疾病、反复流产等多种疾病,因而引起国内外学者的极大关注。
本研究用PCRRFLP方法测定北方健康汉、回、蒙古族人MBL基因ExonI54位密码子点突变的情况,同时用ELISA方法测定血浆MBL含量,并对突变频率与其血浆含量相关性进行分析。
1材料与方法
主要仪器
基因扩增梯度PCR仪;凝胶图像分析系统;低温冰柜;低温高速离心机;分析天平;酶标仪;紫外可见分光光度计;超净工作台;稳压稳流电泳仪;电热恒温震荡水槽。
主要试剂
MBLOligomerELISA试剂盒;TaqDNA聚合酶;dNTP;限制性内切酶BanI。
标本收集与处理
汉族56例标本来自河北张家口市中心血站;回族82例标本来自河北张家口康保地区回族人;蒙古族37例标本来自内蒙古自治区集宁市中旗旗医院。
经体检均为健康人群。
收集静脉血标本EDTANa2抗凝,分离血浆,-86℃保存,供测定MBL含量,含有单个核细胞的下层成分用盐酸胍法提取DNA。
MBLExonI基因54位密码子点突变检测,参照文献[3,4]。
根据酶切结果,针对性地选择完全切割、不完全切割和未切割的PCR扩增产物进行序列分析,测序由大连宝生物公司完成。
用MBLOligomerELISA试剂盒对健康汉、回、蒙古族标本血浆MBL含量进行测定。
2结果
MBLExonI基因54位密码子点突变情况:
PCR扩增产物酶切显示3种情况:
出现232bp和93bp两条带;只显示1条带约325bp,显示325bp、232bp和93bp3条带。
酶切结果与PCR扩增产物的测序结果一致。
证明所扩增产物为MBL基因ExonI的特异靶序列。
图1MBL基因外显子I的PCR产物的BanI酶切鉴定
泳道3:
PCRmarker:
2000,1000,750,500,250,100bp(从上到下);泳道1和7:
不被酶切的PCR产物;泳道5:
野生型GAC/GAC;泳道4:
突变杂合子型GGC/GAC;泳道2和6:
突变纯合子型GGC/GGC。
图2部分不同基因型的MBL基因PCR产物的测序
A、B:
GAC/GAC突变纯合子;C、D:
GGC/GAC突变杂合子不同民族汉、回、蒙古族标本测定结果
56例汉族标本,野生型33例,突变杂合子型20例,突变纯合子型3例;基因频率和。
血浆MBL含量与突变频率相关性:
血浆MBL含量为0~/L。
含量低于/L3例,突变频率;介于~1mg/L21例,突变频率;高于1mg/L32例,突变频率。
经等级资料的相关分析,χ2=,;r=-,二者负相关。
82例回族标本,野生型60例,突变杂合型20例,突变纯合子型2例,基因突变频率。
血浆MBL含量与突变频率相关性:
MBL含量0~/L。
低于/L2例,突变频率;介于~1mg/L23例,突变频率;高于1mg/L57例,突变频率0。
经等级资料的相关分析,χ2=,;r=-,二者负相关。
37例蒙古族标本,野生型25例,突变杂合型11例,突变纯合子型12例,基因突变频率。
血浆MBL含量与点突变频率相关性:
MBL含量0~/L。
低于/L1例,突变频率;介于~1mg/L12例,突变频率;高于1mg/L24例,突变频率0。
经等级资料的相关分析,χ2=,;r=-,二者负相关。
3讨论
MBL通过调理吞噬作用和/或通过结合MBL相关的丝氨酸蛋白酶进一步激活补体而导致其结构破坏,在机体固有免疫应答方面发挥重要作用[1,5]。
大多数研究显示,血清MBL低水平或缺失会增加感染性疾病的易感性和感染的严重性,这与MBL在宿主防御方面发挥着重要作用有关。
血清中MBL的水平主要由MBL编码基因结构决定,并受启动子区域基因的活性调节。
研究已经发现在5′启动子区域有6个突变位点,在ExonI有3个突变位点[6,7]。
其中ExonI中54位密码子突变会干扰MBL多肽进一步组装成功能性多聚体,进而降低血浆中功能性MBL的含量,且在不同的种族中普遍存在,但不同人种的基因突变频率有所不同。
本研究应用PCRRFLP检测MBLExonI基因54位密码子点突变情况,并对部分扩增产物进行了序列分析。
通过用BanI酶对扩增产物进行酶切分析来判定结果,当产物酶切电泳图谱为两条带时,进行双向测序,结果显示54位密码子分别为GGC和GCC;当呈现一条带时,54位密码子分别为GAC和GTC;当呈现3条带时,54位密码子分别为GGC和GC(T)C,测序图显示套峰;酶切结果与测序结果相一致。
健康汉、回、蒙古族结果比较,回族人血浆MBL含量高于蒙古族;蒙古族人血浆MBL含量高于汉族;经方差分析,F=,。
基因突变频率比较:
经χ2检验,χ2汉、蒙=,P>;χ2汉、回=,;χ2蒙、回=,P>。
χ2总=,P>。
以上结果显示:
血浆MBL含量低于/L时,全部为纯合子基因突变者;含量高于1mg/L,大部分(汉族:
%;回族:
100%;蒙古族:
100%)为未突变野生型;介于~1mg/L之间,大部分为基因突变杂合子,余下小比例的标本用BanI酶切的电泳结果显示不突变,这有可能是其它位点的突变而导致血浆MBL含量降低所致。
三民族血浆MBL含量比较回族人含量高于蒙古族,但无显着性差异;蒙古族人含量高于汉族人且差异显着。
三民族基因突变频率比较回族人低于蒙古族,但无显着性差异;蒙古族低于汉族也无显着性差异,但汉、回族基因突变频率比较有显着性差异。
以上汉、回、蒙不同民族结果与文献报道符合,文献中指出MBL的基因型是一个比较合理的衡量群体血浆MBL浓度的预报因子,我们所测得结果中健康回族人血浆MBL含量最高,基因突变频率最低,从上述数据表明MBL基因ExonI54位密码子的突变会明显影响其血浆中MBL的含量。
本研究为进一步探讨中国人MBL基因突变情况与血浆MBL水平及二者的相互关系提供了实验依据,为我们进一步深入研究MBL与临床多种疾病的相关性奠定了一定的基础。
【参考文献】
1李萍,贾天军.甘露糖结合凝集素研究进展[J].中国医学检验杂志,2004,5:
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2Kilpatrickbindinglectin:
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3贾天军,李萍,张庶民,等.蒙古族人MBL基因ExonI54位密码子点突变频率与其血浆含量的相关性[J].细胞与分子免疫学杂志,2004,20:
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4贾天军,李萍.MBLExonI54位基因突变检测方法的建立及初步应用[J].中国生物制品学杂志,2003,16:
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5贾天军,李萍,张庶民.MASPs的结构与功能研究现状.医学综述,2003,9(4):
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6JuligerS,KremsnerPG,AlpersMP,et polymorphismsofthemannosebindinglectingeneinapopulationofPapuaNewGuinea[J].MutatRes,2002,505:
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7WorthleyDL,BardyPG,Mullighanbindinglectin:
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