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基因工程讲义

《基因工程实验》讲义

指导教师林陈水

浙江工业大学药学院

2015年11月

目录

实验一、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

实验二、DNA分子的限制性内切酶消化

实验三、聚合酶链式反应（PCR）扩增目的DNA

实验四、大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA转化

实验五、重组外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

实验六、表达蛋白的SDS-PAGE分析

实验一、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

一、实验目的与内容

1、细菌培养及菌体的收集、裂解。

2、碱裂解法提取质粒DNA。

二、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，其重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

目前大部分实验室采用柱层析法纯化质粒DNA。

操作步骤及注意事项详见试剂盒产品说明书。

三、试剂准备

1．溶液Ⅰ：

50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0）。

1MTris-HCl（pH8.0）12.5mL，0.5MEDTA（pH8.0）10mL，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500mL。

在10lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。

2．溶液Ⅱ：

0.2NNaOH，1%SDS。

2NNaOH1mL，10%SDS1mL，加ddH2O至10mL。

使用前临时配置。

3．溶液Ⅲ：

醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。

5MKAc300mL，冰醋酸57.5mL，加ddH2O至500mL。

4℃保存备用。

4．TE：

10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）。

1MTris-HCl（pH8.0）1mL，0.5MEDTA（pH8.0）0.2mL，加ddH2O至100mL。

高压湿热灭菌30min，4℃保存备用。

5．苯酚（Tris-HCl（pH8.0）平衡）、氯仿/异戊醇（24：

1）

6．乙醇（无水乙醇、70%乙醇）

7．10×TAE缓冲液（pH8.0）：

Tris48.48g，冰乙酸11.42mL，EDTA3.72g，定容至1000mL。

8．溴化乙锭（EB）：

10mg/mL。

本实验采用新型无致癌性的DNA染料代替。

9．RNaseA（RNA酶A）：

不含DNA酶（DNase-free）RNaseA的10mg/mL，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10．6×loadingbuffer（上样缓冲液）：

0.25%溴酚蓝，40%（m/V）蔗糖水溶液。

11．0.8%琼脂糖凝胶：

称取1.2g琼脂糖于三角烧瓶中，加150mL0.5×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右（不烫手），加EB母液（10mg/mL）至终浓度0.5ug/mL（注意：

EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。

缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TAE），即可上样。

四、操作步骤

1．挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3mLLB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜（约12-14hr）。

2．取1.2mL培养物入离心管中，室温离心10000g×0.5min，弃上清，将离心管倒置，用真空泵将上清液小心吸尽。

3．将细菌沉淀重悬于100µL预冷的溶液Ⅰ中，涡旋振荡，使菌体分散混匀。

4．加200µL新鲜配制的溶液Ⅱ，温柔颠倒6~8次混匀（切勿剧烈振荡），使细胞膜裂解，冰浴3~5min（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5．加入150µL预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒6~8次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min（放置时间不可过长，为什么？

）。

溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6．4℃离心12000g×5min，小心移出上清于一新微量离心管中，加入200µL的苯酚和200µL氯仿/异戊醇，振荡1min混匀。

7．4℃离心12000g×5min，小心移出上清于一新微量离心管中，加入400µL氯仿/异戊醇，振荡混匀。

8．4℃离心12000g×5min，小心移出上清于一新微量离心管中（吸上清时注意估算体积），加入2倍体积无水乙醇（为什么?

），混匀，室温放置2-5min。

9．4℃离心12000g×10min，弃上清，1mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀1~2次，4℃离心12000g×10min，弃上清，将沉淀用滤纸或真空吸干。

10．沉淀溶于30µLTE或水（含RNaseA20ug/mL），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

五、质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。

该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。

DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。

这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。

因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA5~10µL，加1/5体积的6×LoadingBuffer混匀上样，采用1~5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

六、注意事项

本裂解法小量制备质粒DNA重复性好一般不影响进一步实验操作。

若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

七、讨论

1．加入溶液Ⅱ后，为什么不能剧烈振荡？

2．为什么质粒DNA电泳呈现多条带？

实验二、DNA分子的限制性内切酶消化及电泳鉴定

一、实验目的

1．掌握限制性内切酶的作用。

2．学习琼脂糖凝胶电泳的方法。

二、实验原理

限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。

绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。

一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。

1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50µL体积1小时内完全切开1ugλ噬菌体DNA所需的酶量。

不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。

但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（Buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。

三、实验准备

1．待消化的DNA片段：

实验一制备得到的DNA

2．限制性内切酶及其缓冲液

3．琼脂糖

4．溴化乙锭EB（10mg/mL贮藏液）

5．10×TAE缓冲液（pH8.0）：

Tris48.48g，冰乙酸11.42mL，EDTA3.72g，定容至1000mL。

6．加样缓冲液：

0.25%溴酚蓝，40%（m/V）蔗糖水溶液，4℃保存。

四、操作步骤

（一）、质粒DNA的酶解

1．将实验一纯化的并经过RNaseA消化的质粒DNA作为DNA样品。

2．将清洁、干净、灭菌的Ep管编号，用微量加样器按表所示将各种试剂分别加入每个Ep管内。

加样表：

样品DNA

µL

限制性内切酶A

µL

限制性内切酶B

µL

10×Buffer

µL

ddH2O

µL

总体积

µL

3．加样后，稍加离心混匀，置于37℃水浴中，酶解2~3h（必要时可以延长或过夜）。

（二）、琼脂糖凝胶板的制备

1．琼脂糖凝胶的制备：

准确称取琼脂糖，置于锥形瓶中，加入TAE稀释液。

微波加热直至溶液清凉，冷却至60℃（不烫手），加入溴化乙锭。

高浓度2.5％

低浓度0.8％

琼脂糖

1.25g

1.20g

0.5×TAE

50mL

150mL

DNA染料

5µL

15µL

2．胶板的制备：

取有机玻璃内槽，洗净、晾干。

用宽胶布将有机玻璃内槽的两端边缘封好，将有机玻璃内槽置于一水平位置，放好样品模板（梳子）。

3．将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，使整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。

室温下静置，待完全凝固后，轻轻拔出样品槽模板。

（三）、加样

在一次性手套上用微量取液器将样品与1/5体积的6×LoadingBuffer混匀，将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。

每槽加样量约10~30µL。

（四）、电泳

加完样品后的凝胶板应立即通电进行电泳。

样品进胶前，应使电流控制在5mA左右，样品进胶后电流为10mA左右（70~100V），当溴酚兰染料移到距离胶板下沿约1~2cm处停止电泳。

（五）、取出电泳后的胶片，在紫外灯下进行观察、摄片，记录电泳结果。

五、注意事项

1．浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。

（思考原因？

）

2．购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。

进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。

每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。

加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

3．尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。

4．通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。

在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。

5．溴乙锭是强烈的诱变剂，并有中度毒性，使用时应带手套，电泳废弃物专门放置或处理，避免溴乙锭污染实验台，溴乙锭贮存液应避光保存。

六、讨论

1．影响限制性内切酶效率的因素有哪些？

2．琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子的原理是什么？

3．样品应放正极还是负极？

为什么？

实验三、聚合酶链式反应（PCR）扩增目的DNA

一、实验目的

1．学习通过聚合酶链式反应（PCR）在体外大量扩增位于两段已知序列间的双链DNA区段。

2．掌握PCR仪的一般操作方法和步骤。

二、实验原理

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。

典型的PCR由高温变性模板→低温下引物与模板退火→适温下引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：

将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶等）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5′→3′方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。

因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。

它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

（1）、生成双链DNA中的特异序列作为探针；

（2）、由少量mRNA生成cDNA文库；

（3）、从cDNA中克隆某些基因；

（4）、生成大量DNA以进行序列测定；

（5）、突变的分析；

（6）、染色体步移；

（7）、RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

三、试剂准备

1．DNA模版

2．对应目的基因的特异引物

3．10×PCRBuffer

4．2.5mMdNTPs：

含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM

5．DNA聚合酶

四、操作步骤

1．在冰浴中，按下表将各成分加入一灭菌的PCR管中，混匀。

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

DNA模板（50ng-1ug/µL）

µL

引物1（10µM）

µL

引物2（10µM）

µL

Mg2+

µL

dNTPmix（2.5mM）

µL

10×PCRBuffer

µL

DNApolymerase（5U/µL）

µL

ddH2O

µL

总体积

50µL

2．调整好反应程序。

将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。

一般：

在94℃预变性3~5min，进入循环扩增阶段：

94℃30s→℃30s→72℃s，循环30，最后在72℃保温10min,14℃保温2min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：

直接取5~10µL电泳检测。

五、PCR反应体系的组成与反应条件的优化

PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCRBuffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。

各个组份都能影响PCR结果的好坏。

1．反应缓冲液：

一般随PfuDNA聚合酶供应。

标准缓冲液含：

50mMKCl，10mMTris-HCl（pH8.3室温），1.5mMMgCl2。

Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。

浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。

在各种单核苷酸浓度为200µM时，Mg2+为1.5mM较合适。

若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。

在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。

据经验，一般以1.5~2mM（终浓度）较好。

2．dNTP：

高浓度dNTPs易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。

PCR中常用终浓度为50~400µM的dNTPs。

四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。

此外，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

因此，dNTPs的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。

3．DNA聚合酶：

在100µL反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。

酶量过多将导致产生非特异性产物。

但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。

当降低反应体积时（如20µL或50µL），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。

4．引物：

引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。

要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：

（1）、引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在40-60%，Tm值高于55℃［Tm=4n（G+C）+2n（A+T）］。

应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。

（2）、引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。

3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。

两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。

（3）、人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

（4）、引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：

一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。

一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。

一般用0.25~0.5pM/µL较好。

（5）、引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100µM），保存于-20℃。

使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10µM或20µM的工作液。

5．模板：

PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。

虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用ug水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。

原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。

6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。

六、注意事项

1．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。

最好设立一个专用的PCR实验室。

2．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。

一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

3．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。

操作过程中均应戴手套。

4．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22µM滤膜过滤除菌或高压灭菌。

5．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

6．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

7．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

七、讨论

1．步骤2中，为什么第一次变性要3~5min？

为什么循环结束后要在72℃下保温10min？

2．新扩增出的DNA的量与哪个因素关系最大？

3．为什么[Mg2+]对反应的特异性及产量有着显著影响？

实验四、大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA转化

一、实验目的

1．学习感受态细胞的制备。

2．学习将外源基因导入细胞的方法。

二、实验原理

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-，M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，RbCl（KCl）等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenentcells）。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法为使用更广泛。

本实验以E.coliJF1125菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pET质粒共保温，实现转化。

由于pET质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），可通过Amp抗性来筛选转化子。

如受体细胞没有转入pET，则在含Amp的培养基上不能生长。

能在含Amp的培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pET。

转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

三、实验准备

1．材料：

E.coliJF1125菌株；pET质粒DNA（购买或实验室自制）；离心管（EP，eppendorf）。

2．设备：

恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，分光光度计，微量移液枪。

3．LB液体培养基：

胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用）5g，NaCl10g，加ddH2O至1000mL，完全溶解，分装小瓶，湿热高压灭菌20~30min。

4．1.5%琼脂LB固体培养基：

称取1.5g琼脂粉放入300mL锥形瓶，加100mLLB，高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。

5．抗生素（Amp或Kan）母液：

100mg/mL。

6．含抗生素的LB固体培养基：

将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入抗生素母液，使终浓度为100ug/mL，摇匀后铺板。

7．0.1mol/LCaCl2溶液：

称取1.11gCaCl2（无水，AR），溶于适量去离子水中，定容至100mL，高压灭菌。

8．含15%甘油的0.1mol/LCaCl2：

称取1.11gCaCl2（无水，AR），溶于适量去离子水中，加入15mL甘油，定容至100mL，高压灭菌。

四、操作步骤

（一）、受体菌的培养

从LB平板上挑取新活化的E.coliJF1125单菌落，接种于3mLLB液体培养基（不含抗生素）中，37℃200rpm振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:

100-1:

50的比例接种于100mLLB液体培养基（不含抗生素）中，37℃，250rpm振荡培养2~3小时至OD600＝0.3~0.5左右（细胞数<108/mL）。

（二）、感受态细胞的制备（CaCl2法）

1．取1mL菌液于1.5mLEP管中，3000g离心5min，弃上清（可用加样器将残余液