DNA遗传分析系统及主要应用方向.docx
- 文档编号:11982511
- 上传时间:2023-04-16
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:187.88KB
DNA遗传分析系统及主要应用方向.docx
《DNA遗传分析系统及主要应用方向.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DNA遗传分析系统及主要应用方向.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
DNA遗传分析系统及主要应用方向
Li-Cor4300DNA遗传分析系统及主要应用方向
Li-Cor4300DNA遗传分析系统采用双色红外荧光检测技术进行核酸研究,通过固态激发器和检测装置激发红外荧光染料信号,实时检测标上红外荧光染料的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳过程,得到清晰的图象,由专业针对各种应用的分析软件分析得到实验结果。
主要应用在Tilling、Ecotilling、AFLP、STR、测序等领域。
一、Tilling
随着基因序列数据库的不断扩充,反向遗传学方法正逐步替代以表型筛选为主的正向遗传学方法成为功能基因组学研究的主要方法。
反向遗传学是在已知基因序列的基础上去分析研究基因的功能,反义RNA抑制、RNAi和插入突变是植物中常用的用于反向遗传学的研究方法,但这三种技术均需复杂繁琐的植物转基因表达载体构建过程以及组织培养、基因转化和周期极长的转基因植物筛选过程,作为常规方法仅限于应用于极少数物种。
为了更好的进行植物功能基因组学研究,美国华盛顿FredHutchinson癌症研究中心的研究者们建立了一种全新的反向遗传学方法——定向诱导基因组局部突变(TargetingInducedLocalLesionsInGenomes,TILLING),它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li-Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合,快速有效地从化学诱变剂(EMS)诱变产生的突变群体中鉴定出点突变,这一全新的、高通量、低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。
1.TILLING技术路线
TILLING技术先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变,提取突变体M2代的DNA,把多个待测样品的DNA混合在一起进行PCR,PCR产物通过先变性再复性过程得到异源双链。
如果样品发生点突变,则形成的异源双链中必定含有错配碱基,利用特异性的内切核酸酶识别携带了错配碱基的异源双链并在错配处切开双链,最后进行电泳检测试验结果。
如果发现阳性结果,则再在混合的样品中逐一检测,最后确定阳性样本。
Colbert等所描述的TILLING技术主要操作流程见表1。
这个过程中起重要作用的CEL1酶是从芹菜(celery)中分离出来的植物所特有的核酸内切酶,它能够识别单碱基错配并在错配碱基的3’端进行切割,酶切产物经变性PAGE胶分离,能将超过1kb的PCR产物内的点突变定位在几个碱基对内。
表1:
植物中TILLING的技术路线
1
EMS(EthylMethaneSulfonicacid)处理种子,诱导产生一系列点突变
2
将种子培养,获得第一代突变个体(M1)
3
M1植株自花授粉,产生第二代植株(M2)
4
M2植株抽提DNA存放于96孔板,并保留M2代种子
5
将多个96孔板的DNA样本合并到1个96孔板内(最多可合并8个),得到DNA池,根据目标基因设计一对特异性引物对DNA池进行PCR扩增,两条引物分别用700nm和800nm荧光染料标记。
6
PCR产物通过变性、退火,得到野生型和突变型所形成的异源双链核酸分子
7
用特异识别并切割错配碱基的核酸内切酶(CEL1)剪切异源双链核酸分子
8
酶切产物变性产生两条DNA单链分子,其碱基数目之和与酶切之前片断碱基数相同
9
酶切产物在Li-Cor4300DNA分析系统上经变性的聚丙烯酰胺(DPAGE)凝胶电后泳,分别得到700nm和800nm两张图。
发生突变的泳道,在700nm的图上可以在野生型条带下方看到一个条带,同时在800nm的图上相同的泳道也会有一个条带,这两个条带就是CELI核酸酶的剪切产物,两个条带片断大小之和等于扩增片段的大小,从而很容易对扩增产物进行突变检测
IRDye700nm
IRDye800nm
10
当混合样本检测到突变后,要对混合样本中的每个DNA样本再次进行筛选,检测出发生突变的DNA样本,并对PCR产物进行测序验证,再进行突变表型鉴定。
2.TILLING技术的特点
2.1一种全新的反向遗传学研究方法
传统的化学诱变方法,能诱发产生高密度的点突变,不仅便于农作物诱变育种的实际所需,也有助于基因的精细定位和了解蛋白质的功能,在基因功能的分析方面具有独特的技术优势。
传统化学诱变方法在表型选择方面依旧被广泛利用,但点突变鉴定困难限制了其在功能基因组学研究中的应用。
与其它基因敲除的突变方法相比较,TILLING技术的基本点是诱发突变和突变的高效筛选,即有效结合高频率点突变和PCR筛选技术,可发现错义突变、基因截短型损伤等突变类型,表现了三方面的技术优势:
(1)可获得大量的等位基因系列,对一些表型分析时可能涉及的亚致死必需基因、长度很小基因、复等位基因等具有独特的技术优势;
(2)可诱导产生高频率的点突变,筛选目的基因需要较小的突变群体;(3)不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统,无需耗时的转基因和复杂的组织培养过程。
2.2高通量、低成本,可自动化操作
由于集成了高通量的电泳检测设备、优秀的图像处理系统和分析软件及一种能够给96孔微量滴定板自动加样设备等多种技术,TILLING可自动化操作。
目前,在拟南芥TILLING研究计划中(ATP,ArabidopsisTILLINGProject)已实现完全自动化。
对突变体的规模化筛选,TILLING无需借助先进的仪器设备,是一种高通量且相对廉价的实用技术。
筛选每块96孔微量滴定板相当于筛选了768(8×96)个M2单株,每个目标筛选区段大约为1kb,每块胶大约可以检测750kb的基因组序列。
一个技术员一天就能完成4轮筛选,可检测3000个突变株,相当于检测了300万个碱基对。
对于突变频率高的群体,一天可筛选出20个突变,至少可以鉴定出一个基因。
2.3能有效排除假阳性
TILLING采用了双色红外荧光检测技术(通过Li-Cor4300DNA遗传分析系统)来检测CELI酶切产物,能够有效排除假阳性条带。
假阳性通常存在两种情况:
一个通道的电泳图中多个泳道出现阳性条带或者两个通道获得的两张电泳图相同泳道在相同位置出现阳性条带。
因为多个单株出现相同点突变的可能性很低,推测发生前一种情况的可能是由于某种同源双链对CELI酶特别敏感,能被其酶切,使得同样条带出现在一张电泳图的不同泳道上;发生后一种情况的可能是由于错误导致产生大量的相同大小的双末端标记产物。
因此,采用双色红外检测技术具有非常明显的优势,只有两个通道获得的两张图片在同一泳道出现片断大小之和与野生型条带大小相等的情况下,才是候选的阳性点突变。
3.TILLING技术的应用
3.1广泛用于植物功能基因组学研究
将红外检测技术同TILLING技术结合,其优势已经被全世界许多实验室证实。
美国国家科学基金会植物基因组计划(NSFPlantGenomeResearchProgram(PGRP))近年来大力发展高通量TILLING,并直接推动了以美国为首的北美实验室联合启动拟南芥TILLING项目(ATP,ArabidopsisTILLINGProject)。
以美国为首的北美实验室借助TILLING技术,直接推动了拟南芥功能基因组学项目的建立。
该项目目前已经找到了拟南芥的400多个基因的4000多株突变植株,研究者利用6台Li-Cor4300DNA遗传分析系统,每8h进行两轮筛选,每天可检测大约10000拟南芥单株、筛选3个基因的惊人水平。
研究者还将ATP的模式应用到重要粮食作物玉米(Maize)上,玉米基因组很大,组织培养也很困难,一直以来很难将反向遗传学的常用技术(反义RNA、RNAi等)用在玉米的基因组学研究上,而应用TILLING技术则很容易解决这个难题。
此外,国际上不少研究单位以TILLING为技术平台,开展了水稻(Rice)、百脉根(Lotusjaponicus)、小鼠(mouse)、斑马鱼(Zebrafish)、果蝇(Drosophilamelanogaster)、线虫(Caenorhabditiselegans)等生物的功能基因组学研究。
3.2有机结合诱变技术和生物技术,作为分子育种的特例用于农作物突变分子育种
EMS是一个高效稳定的烷化类诱变剂,能诱发产生高密度的系列等位基因点突变,不但为农作物诱变育种的选择提供空间,而且有利于基因的精细定位和了解基因的功能。
尽管EMS在表型选择方面依旧被广泛利用,但存在EMS诱发产生的点突变难以鉴定的问题。
TILLING技术,实现了高频率点突变与现代分析技术——红外双色检测技术有效结合,不仅可获得点突变的等位基因系列,而且仅需较小的突变群体就可筛选到目标基因的突变体。
因此,按目的基因序列设计特异性引物,TILLING提供了从分子水平上定向规模化筛选突变体的技术平台,尤其对品质和营养成分等无法从植株表型上加以选择或耐逆、恢复性、不育性等难以快速评价的性状筛选尤为有利。
相对于转基因和分子标记辅助选择等分子育种,基于TILLING的诱变技术,将是一种高效定向性的育种技术,它不但继承了诱变育种稳定快、与原亲本相仿只改变单个目标性状的传统优点,而且无须耗时的转基因和连续的杂交、回交过程,在选种育种和改良作物品种上具有很大的应用价值。
作为一种高通量、低成本的反向遗传学研究方法,TILLING技术无需先进的生物学仪器设备,基因组序列信息为其提供了良好的研究素材。
有理由相信,随着基因组学的不断发展,TILLING技术将会得到更加广泛的应用。
二、Ecotilling
由于Tilling技术应用时需要进行化学诱变,所以研究对象一直被限定在动植物中,在Tilling技术基础上发展起来的Eco-tilling技术(theTillingtechniquetosurveynaturalvariationingene)则不需要进行化学诱变,基本操作过程如下:
(1)确定变异组和阴性对照。
通常,阴性对照为一基因序列已知的表观正常对象(在植物中为常规品种;研究人时,则为正常人)。
(2)集中(pooling)。
提取变异组和阴性对照的DNA并按1∶1的比例混合置于微孔板中,再将8块微孔板混合在一起。
其余操作与Tilling技术的操作相同。
用于发现DNA多态性的常用方法有:
测序、单链构象异构多态性(SSCP)、杂交和微阵列等。
这三种方法各有利弊,测序的花费较高,时间也较长;SSCP的通量虽然较高,但对于新发突变,其检出率较低,此外,用该方法检测的待测片段长度一般只能在200~300bp;杂交和微阵列不但花费高,而且检出率不足50%。
与以上三种方法相比,Ecotilling技术除了具有通量高、成本低、定位准确等优点外,还允许待测片段较长,对于一段长度在1kb左右的基因序列来说,只需一次便可以覆盖全长。
Ecotilling技术主要用于自然种群植物的SNP分析,或用来发现人类基因多态性和筛查致病基因。
随着农业研究与生命科学的不断发展,以及各个学科之间的交叉发展,目前Ecotilling技术已渗透到医学遗传学领域中。
利用Ecotilling技术筛查目的基因突变具有以下可行性:
(1)人是二倍体,存在两套染色体,通过变性和复性很容易获得异源双链。
(2)人类基因组序列已经完成,可以很方便地设计引物并对检测到的突变进行定位。
(3)阿尔茨海默病、糖尿病、骨质疏松等疾病均属于多基因遗传病,要想研究其发病机制就必须要进行大规模的相关基因多态性的筛选,对于已收集到病例样本和家系的实验室来说,采用Ecotilling技术进行筛选是最高效、经济易行的。
三、AFLP
1.AFLP的原理
扩增性片段长度多态性(Amplifiedrestrictionfragmentlengthpolymorphism,AFLP)是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段:
基因组DNA先用两种限制性内切酶切割,形成分子量大小不等的DNA片段,然后将双链接头连接到DNA片段的末端,接头序列和相邻的限制性位点序列,作为引物结合位点,PCR引物3’端添加选择性碱基,选择性碱基延伸到酶切位点区,选择性的扩增两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段,产生分子量不等的许多DNA片段,扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。
由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带,而在另一品种中可能无此谱带产生,因此,这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记,可在一次单个反应中检测到大量的片段。
2.AFLP分析的一般过程
AFLP分析主要包括三个步骤:
DNA完全酶切及人工接头的联接;预扩增和选择性扩增;产物凝胶电泳检测。
具体流程如下:
a)首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA,然后进行双酶切,通常选用一种6碱基识别位点的常用限制性内切酶(通常是EcoRI),另一种罕见限制性内切酶(如MseI)。
b)酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接,形成带有接头的特异性片段。
c)DNA片段的预扩增。
d)在Taq聚合酶的作用下,完成AFLP的选择性扩增。
e)PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。
f)多态性比较分析,特异片段回收克隆分析。
在AFLP引物设计中,3’末端上选择性碱基的数目多少决定了AFLP扩增产物的多少。
一般根据基因组DNA的大小确定引物末端所需的选择性核苷酸数目。
大于l08bp的基因组DNA可以用两个末端各有3个选择性碱基的引物进行扩增(3+3引物组合);l05-l08bp的基因组DNA可以用两个分别含有2个或3个选择性核苷酸的引物进行扩增(即2+3引物)。
同时选择性引物通常标记上便于检测的物质,常用的有同位素标记、硝酸银标记和荧光染料标记三种。
同位素标记灵敏度高于硝酸银标记,但存在放射性污染且操作复杂。
荧光标记方法操作简单,无放射性污染,同时,获得的DNA指纹与相应的放射自显影相比,减少了一些没有意义的条带,加强了该技术的高效性和可重复性。
GenomicAFLP
cDNA-AFLP
3.AFLP技术的应用
AFLP具有可靠性好,重复性强,可信度高等优点,近年来广泛应用于遗传育种和基因组研究,包括做:
a)构建遗传连锁图谱
b)快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记
c)AFLP辅助的轮回选择育种
d)利用AFLP技术研究基因表达与调控
e)鉴定品种绘制指纹图谱
f)遗传多样性的研究
4.Li-Cor4300用于做AFLP的优势
红外荧光检测技术在AFLP研究中的应用已日益广泛,该领域的许多文章都使用Li-CorDNA分析系统完成。
Li-Cor公司针对AFLP研究提供包括试剂(Pre-mixedgelMatrix、GenomicAFLP®Kits)、仪器、分析软件在内的全套AFLP分析解决方案,不仅能进行传统的基因组AFLP分析,还提供专门的试剂盒(AFLP®ExpressionKits)进行表达性的cDNAAFLP分析,结合LI-COR的Odyssey红外荧光扫描成像系统,还可将AFLP电泳条带回收进行进一步的研究,为研究者提供极大的便利。
分析软件方面,仅针对AFLP一项就有GeneImagIRTM,SAGAMX,AFLPQuantarTMPro三种不同的软件,分别满足一般性用户、专业用户和特殊的共显性分析的需要,彻底解决数据分析的瓶颈制约。
四、微卫星
微卫星(microsatelliteanalysis),即短串联重复(Shorttandemrepeat,STR),是由2-6bp重复单位构成的DNA序列,通常多态性片段长度在100-300bp。
以人类基因组为例,平均每15-20kb就存在1个STR座位,据此估计整个人类基因组中大约有50,000-100,000个STR位点。
由于它具有高度的多态性和遗传稳定性,所以非常适合作为遗传学DNA分子标记,目前STR分析已广泛应用于遗传制图、连锁性分析、亲子鉴定、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域。
采用Li-Cor4300红外激光遗传分析系统,配合功能强大的SAGAGT基因型分析软件,可以保证结果的准确无误。
更可提供真实电泳图像,方便进行多样本的相互比对。
五、DNA序列测定
1.测序原理
以DNA单链为模板,在特定条件下,用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则,不断将4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)加到引物的3'-羟基末端并使引物链得到延伸。
链的延伸通过引物的3'-羟基和脱氧核糖核苷酸底物的'-磷酸基团形成磷酸二酯键来完成。
如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸(ddNTP),这种2'3'ddNTP的5'-磷酸基团是正常的,而3'位置缺少羟基,因此在DNA聚合酶作用下,仍然可以通过5'-磷酸基团与引物链的3'-羟基反应掺入到引物链中,但是由于ddNTP没有3'-羟基,不能继续与下一个5'-磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。
这样,在测序反应体系中,DNA引物链不断合成与偶然终止,产生一系列的长短不等的核苷酸链。
然后将这些测序反应产物进行电泳。
1.引物标记法:
将荧光素标记在测序反应所用引物的5’端
2.末端标记法:
将荧光素标记在作为终止物的ddNTP上
2.4300测序优势
特有全球领先的红外长程测序技术,单向测序长度保证700-900bp,短序列准确度很高。
1.5kb序列,双向反应,一次读通,省却二次引物合成。
99%以上的准确率,并提供真实电泳影象,方便校对及发表论文。
同时,独有SimultaneousBi-directionalSequencing技术,实现同时双向测序,准确高效。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DNA 遗传 分析 系统 主要 应用 方向
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)