内质网应激蛋白Xbp1在果蝇饥饿过程中的功能及其作用机制研究细胞生物学专业毕业论文.docx
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内质网应激蛋白Xbp1在果蝇饥饿过程中的功能及其作用机制研究-细胞生物学专业毕业论文
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山东大学硕上学位论文
(6)使用PBST配制的5%驴血清室温封闭30分钟;(7)于湿盒中,室温一抗孵育一小时或4℃过夜;(8)用PBS缓冲液清洗3次,每次10分钟;(9)在湿盒中二抗(594驴抗兔抗体1:
1000稀释于5%驴血清)避光孵育30
分钟;(10)用PBS缓冲液清洗3次,每次5分钟;
(11)滴加一小滴含有DAPI的封片剂于载玻片中央,将24孔板中的爬片取出,
细胞面向下铺在封片剂上,注意不要产生气泡;(12)使用指甲油封住爬片周边封片,于激光共聚焦显微镜下观察。
2.9果蝇抗饥饿能力检测实验
(1)培养相同批次不同基因型果蝇各100只,按每管20只分装至培养管中并编
号;
(2)同时对各组果蝇开始饥饿处理;
(3)将果蝇培养在果蝇培养箱中,每12小时记录并统计存活数量,并计算存活率,直至存活率变为0;
(4)使用数据分析软件Graphpad中的存活曲线分析所得数据。
2.10S2细胞质粒转染实验本实验所使用质粒由中科院上海生命科学院营养所刘勇研究员提供。
使用Qiagenefl’ectenetransfectionreagent(ETR)试剂盒进行转染原理:
ETR是非脂质体的脂类转染剂,将DNA与浓缩增强子和优化的缓冲液混合使用以达到高转染效率。
浓缩增强子先聚合DNA分子,ETR随后用阳离子脂质包围聚合的DNA分子。
步骤:
(1)将S2细胞传代入若干6cm培养皿中并培养于恒温培养箱中;
(2)待细胞汇合度达到60%至70%左右时,准备开始转染;(3)准备若干EP管并于管盖上表明所需的对应基因备用;
(4)于各EP管中加入300ulbufferEC,16ulenhancer以及对应质粒,混匀后于室温下放置5分钟;
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(5)于各EP管中加入20uleffectene试剂,混匀后于室温放置20分钟;(6)于超净台内,将各EP管中的混合液分别加入培养有s2细胞的6cm培养
皿中,轻摇培养皿以使液体混匀,在皿盖上标注所转染的质粒及时间后重
新将细胞放回培养箱培养48小时。
2.11果蝇幼虫嵌合体表达实验
利用hsp热激蛋白激活np重组酶,剪切cd2终止密码子以表达actin—gal4,
表达相关基因的同时也表达gfp,绿色区域就是表达目的基因的区域。
(1)将hspnp;act>cD2>Gal4,UAS—GFP品系的果蝇与外源表达目的基因的果蝇品系杂交,获得能通过hspflp系统在果蝇脂肪体内以嵌合体形式表达目的基因的果蝇杂交系。
(2)培养获得的杂交系果蝇,通过免疫组织化学染色的技术手段研究不同基因型对性状的影响。
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结果
1内质网应激蛋白Xbpl在果蝇饥饿过程中的作用
1.1Xbpl影响果蝇在饥饿条件下脂肪的积累Xbpl己被证明参与调控糖脂代谢8-12前期的研究表明在小鼠肝脏中,
XBPl通过影响过氧化物酶体增殖激活受体位(PPAR伍)调控饥饿引起的代谢适应反应12。
为了检测Xbpl是否影响果蝇在饥饿条件下的代谢适应反应,我们进行了尼尔红染色实验,结果显示,与对照组相比,饥饿48小时条件下,特异性敲低dXbpl的果蝇的脂肪体中,脂肪含量显著下降。
在正常喂食条件下,过表达dXbpls的果蝇脂肪体中脂肪含量与对照相比明显升高(图1A)。
3龄果蝇幼虫脂滴染色的结果与果蝇成虫检测结果类似,dXbpl敲低的果蝇幼虫在饥饿8小时后,脂肪含量显著降低(图1B)。
ACgG4>+dXbpl·RidXbpls
Fed
BCgG4>
Fed
Starved
图1成虫果蝇及3龄幼虫脂肪体染色分析。
(A)果蝇成虫脂肪体脂滴染色,DAPI
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为细胞核特异性染料,由左至右为对照组;dXbpl敲低组;dXbpls过表达组。
(B)3龄果蝇幼虫脂滴染色,由左至右为对照组;dXbpl敲低组:
dXbpls过表达组。
Fig.1Analysisoffatbodyfromdrosophilaand3instarlarvaewithNileRedstaining.
(A)FatbodylipiddropletfromdrosophilaWaSstainedwithNileRed,nucleiwerevisualizedbyDAPIstaining.(B)Fatbodylipiddropletfrom3instarlarvaewasstainedwithNileRed.
与染色分析结果对应的,饥饿条件下果蝇的三酰基甘油(TG)水平检测实验结果显示,无论在正常喂食还是饥饿条件下,与对照组果蝇相比,dXbpl敲低的果蝇的三酰基甘油水平均显著下降,在dXbpls过表达的果蝇中,三酰基甘油
水平均比对照组果蝇升高。
dXbpl敲低的果蝇在饥饿的条件下三酰基甘油水平下
调的更加显著(图2A)。
糖原水平检测实验结果表明,在正常喂食和饥饿条件下,敲低dXbpl的果
蝇体内糖原水平较之对照组果蝇均显著降低,而dXbpls过表达的果蝇体内糖原水平在正常喂食和饥饿的条件下亦都显著降低。
dXbpl敲低组的果蝇在饥饿的条件下糖原水平的下降倍数与正常喂食情况下无明显差别(图2B)。
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;
>+4>+
>dXbpl·RiO54>dXbpl—Ri
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FedStarvedFedStarved
图2饥饿条件下果蝇成虫三酰基甘油(TG)以及糖原检测实验。
(A)饥饿48小时后不同基因型果蝇三酰基甘油水平;(B)饥饿48小时后不同基因型果蝇糖原水平(A—B:
宰P<0.05,n=3,差异有显著性意义)。
Fig.2Determinationthetriglyceridelevelandglycogenlevelindrosophilaafter48hoursstarvation.(A)Thetriglyceridelevelsindifferentgroupsafterstarvationfor48hours;(B)Theglycogenlevelsindifferentgroupsalterstarvationfor48hours.(DatawerepresentedaSmeans+SEM,n23,幸P<0.05,
byunpairedtwo—tailedStudent’st-test).
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山东大学硕士学位论文1.2Xbpl影响饥饿条件下果蝇的存活率
dXbpl对果蝇饥饿过程中脂肪的消耗有明显影响,这个结果符合我们对dXbpl参与调控果蝇饥饿过程中的脂肪消耗过程的假设。
饥饿条件下,包括脂肪分解在内的代谢反应的调控决定了有机体内能量的平衡,为了进一步确认dXbpl在果蝇饥饿过程中的作用,我们进行了果蝇在饥饿条件下存活率的检测实验。
通过果蝇在饥饿处理的情况下的存活率检测实验,我们发现,在持续饥饿的条件下,
dXbpl敲低组的果蝇在第4.5天时全部死亡,死亡一半的时间(HalfLifeTime)为1天,与对照组果蝇的5.5天相比,差异显著。
dXbpls过表达组的果蝇在饥饿条件下存活时间为9.5天,死亡一半的时间为7天,与对照组的5.5天相比显著延长(图3)。
由此,我们初步确定dXbpl在果蝇饥饿过程中对代谢反应的影响主要是通过影响果蝇脂肪体中的脂肪消耗作用而产生,在接下来的分子生物学实验中,我们将对这一过程的机制做进一步探究。
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零80G4>dXbpI-Ri
G4>dXbpls葡60
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024681O
图3饥饿条件下果蝇生存曲线。
白色组为对照组果蝇,黑色组为Xbpls敲低型果蝇,红色组为Xbpls过表达型果蝇。
Fig.3Thesurvivalcurvesof3groupsofdrosophilaunderstarvationcondition.Thenumbefsofdeaddrosophilawerecountedateachhour(5bottleineachgenotype,20drosophilas/bottle)andthesurvivalratecurveofdrosophilawithlog-rankinGraphpadwasappliedtoexplorethelifespanofvariousgenotypeofdrosophilaunderstarvationconditions.
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2dXBPIs导致dFOXO蛋白水平变化
2.1dXBPIs表达水平的变化导致dFoxO下游分子及部分脂肪代谢调控分子mRNA水平变化在饥饿条件下,Insulin.FoxO途径是一条经典的激活途径,而在最新的报道
中,剪切形态的XBPI(XBPls)N以通过与FOX01蛋白相互作用,导致其被蛋白酶体降解,从而影响小鼠葡萄糖稳态的调控¨。
FOX01还是一个己知的参与代谢,增殖,存活等多种功能途径的分子,并在脂肪细胞的分化过程中起到重要作用28-30。
所以,我们通过实时定量PCR检测了在对照组,dXbpl敲低组和dxbpls过表达组的果蝇中dFoxO及其下游分子的mRNA水平变化,qPCR实验结果显示,与对照组相比,cLXbpl敲低组以及dXbplS过表达组的dFoxO的mRNA水平在饥饿条件下没有明显变化(图4A)。
但是,在饥饿条件下,dFoxO下游的Bmm的mRNA水平在dXbpl敲低组中与对照组相比显著升高,而在dxbpl过表达组中与对照组相比有所下降。
在正常喂食情况下,与对照组相比,BmmmRNA的水平在dxbpl敲低组是下降的,Bmm表达产物是果蝇体内脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的同源类似物,是与脂肪分解的初级步骤有关的基因,这一结果提示饥饿条件下,dXbpl可能通过调控dFoxO下游的Bmm基因调控脂肪的分解过程(图4B)。
另外,其他dFoxO下游的分子如4ebp,lnR等的mRNA水平在dXbpl敲低组中与对照组相比均显著升高,在dXbpIs过表达组中与对照组相
比均显著下降,这种变化趋势在饥饿处理时比在正常喂食处理时更加明显(图4c—D)。
这些实验结果提示,在饥饿条件下,尽管dFoxO的mRNA水平不受dXbpl的影响,但其下游分子的mRNA水平变化表明了dXbpl可能通过其他途径调控
了dFOXO蛋白的功能。
本次实验中我们还检测了与脂肪合成有关的脂肪酸合酶(Fas)基因以及与
脂肪分解次级步骤有关的激素敏感脂肪酶(Hsl)基因的mRNA水平。
实验结果显示,无论饥饿处理还是正常饮食,dXbpl敲低组中的FasmRNA水平与对照相比都有下降的趋势,而在dXbpls过表达组中,FasmRNA的表达呈升高的趋势(图4E)。
Hsl的mRNA水平在正常喂食和饥饿处理时,dXbpl敲低组及dXbpls过表达组的变化趋势大致相同(图4F)。
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图4实时定量PCR检测相关基因mRNA表达水平变化。
(A—F:
依次为dFoxO;Bmm;InR;4ebp;Fas;Hsl的mRNA在正常喂食和饥饿情况下的水平变化。
Cg>+为对照组,Cg>dXBPl-Ri为Xbpl敲低组,Cg>dXBPls为Xbpls过表达组。
+P<0.05,}+P<0.01,}}+P<0.001,n=4,差异有显著性意义)。
Fig.4qPCRanalysisofthemRNAlevelsoffatmetabolicrelatedgenes(FoxO,Bmm,4ebp,InR,Fas,Hsl)in3differentgenotypesundernormalfeedingorstarvationcondition.A—F:
dFoxO,Bmm,InR,4ebp,Fas,Hslrespectively(Resultsareshownasmeans士SEM,from4independentexperiments,枣P<0.05,4术P<0,01.+4+P<0.001byunpairedtwo-tailedStudent’St-test).
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2.2饥饿条件下dXbpls能够使dFOXO蛋白含量降低
为了探究dXBPl与dFOXO之间的关系,我们进一步进行了果蝇幼虫脂肪体细胞的免疫荧光实验。
实验结果显示,与正常喂食组相比,饥饿条件下的果蝇幼虫脂肪体细胞胞浆中的dFOXO蛋白含量显著降低,在与dXBPls同时过表达的情况下,dFOXO蛋白的含量显著降低。
作为对照的mcd8没有发生明显变化(图5)。
R4G4>dFOXO-GFPdXBPls;dFOXO.GFPdXBPls
Fed
Starved
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图5果蝇幼虫脂肪体细胞免疫荧光实验。
实验组由左至右分别为Gal4驱动的dFOXO过表达组,dXBPls与dFOXO同时过表达组,dXBPls过表达组:
由上至下分别为正常喂食处理组和饥饿处理组。
对照组由左至右分别为Gal4驱动的MCD8过表达组,MCD8与dXBPls同时过表达组,绿色代表GFP,蓝色代表细胞核,红色代表d)(BPls。
Fig.5Immunofluorescencestainingofdrosophilafatbodysectionswithdifferentantibodies.dXBPlswasstainedtopurple,dFOXOandMcd8wel"estainedwithgreenfluorescence,andnucleiwerevisualizedbyDAPIstaining.MCD8wasexploitedasanegativecontr01.
曼皇
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2.3dXBPls促进dFOXO蛋白的降解,且该过程依赖于蛋白酶体
以上数据表明,dXBPls促使dFOXO含量降低,所以我们设计了相关的实验去探究dFOXO含量降低的机制。
转染果蝇胚胎细胞s2细胞,收集蛋白,通过蛋白免疫印记法检测蛋白水平变化。
结果显示,dFOXO蛋白水平随着dXBPls表达水平升高而降低,呈明显的负相关趋势,表明dXBPls能够使dFOXO蛋白含量降低(图6A)。
放线菌酮(CHX)是一种能够抑制真核生物的蛋白质合成过程的化合物,其作用主要通过干扰翻译过程中的易位步骤完成,在分子生物学研究中常被用来抑制体外培养的真核细胞蛋白质合成。
用固定浓度(20ug/m1)CHX处理的系列时间点检测结果显示,经过CHX处理,dFOXO蛋白的稳定性较高而dXBPls蛋白的稳定性较低,而二者同时存在的情况下,dXBPls仍然能够使dFOXO蛋白水平显著降低(图6B)。
由于一个稳定性较低的蛋白通过影响蛋白质合成的方式影响一个稳定性较高的蛋白的含量的可能性比较低,我们推测,dXBPls可能是通过影响dFOXO蛋白稳定性的方式影响了其含量。
有研究报道称,在小鼠体内,XBPls可能导致FOXO通过蛋白酶体途径降解,所以我们使用蛋白酶体抑制剂MGl32(20uM/L)处理分别过表达了dFOXO和dXBPls以及二者同时过表达的果蝇s2细胞并通过蛋白免疫印迹法检测蛋白水平变化,结果显示,在无MGl32处理的情况下,过表达dXBPls使dFOXO蛋白水平显著降低,而使用MGl32处理之后,在dXBPls和dFOXO同时过表达的样品中,dXBPls的表达水平与无MGl32处理的情况下无明显变化,但是,dFOXO的蛋白水平与无MGl32处理组相比显著升高。
提示dXBPls促进dFOXO蛋白的降解,且该过程依赖于蛋白酶体(图6C)。
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pAC-dFoxoCHX(hl百百雨再i百f五百fomxBPlioxBph
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●_-●【dFOXO’V5
一蔓-·,dxBPls·V5
——●——————■●Tubu¨n
图6蛋白免疫印记法检测蛋白水平变化实验。
(A)dXBPls的表达量与dFOXO
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的蛋白表达水平的关联。
(B)20ug/ml放线菌酮CHX处理不同时间点后不同表达样品的Westernblotting结果。
(C)20uM/LMGl32处理的不同表达样品的Westernblotting结果。
Fig.6WesternblottinganalysesoftheeffectofdXBP1sondFOXOproteinexpressioninS2cells.(A)TheresponseofvariousdXBP1sexpressionlevelondFOXOproteinexpression.(B)TheeffectofCHX(20ug/m1)onproteinexpressiononbothdXBPlsanddFOXO.(C)TheeffectofMGl32onthemodulationoftheexpressionofdFOXOproteinexpressionbydXBPls.
2.4饥饿处理情况下dXBPIs引起的dFOXO降解主要依赖于蛋白酶体而不是胰
岛素途径
饥饿处理情况下,Insulin—FOXO信号途径是一条经典的被激活途径,有研究报道称,激活胰岛素受体,会导致AKT的磷酸化和激活,继而导致FOXO的磷酸化和出核28’29;胰岛B细胞的增殖,促胰岛素的分泌过程以及胰岛素的分泌过程在Xbpl敲除的小鼠体内均受到损害31;XBPls过表达可以显著地促进胰岛B细胞的增殖强;IREl.Xbpl途径可以起到保护性作用,帮助胰岛p细胞适应胰岛素产量增加”134;另外,IREl一Xbpl途径和转录激活因子ATF6均与胰岛素的分
泌过程以及胰岛B细胞的存活关系密切35-37。
所以,我们使用Insulin(10ug/m1)处理体外培养的果蝇S2细胞(转染48后予
以饥饿处理12小时,Insulin处理6小时),通过WesternBloaing技术检测相关蛋白水平的变化来验证Insulin途径是否参与了饥饿处理条件下dXBPls导致dFOXO降解的过程。
实验结果表明,Insulin处理使AKT磷酸化水平升高,证明S2细胞中的胰岛素信号通路被激活,这使dFOXO表达量有所升高,但dXBPls仍然促进dFOXO的降解(图7A)。
Insulin与MGl32同时处理S2细胞(转染48后予以饥饿处理12小时,Insulin、MGl32处理6小时),WesternBlotting的结果显示,Insulin处理对于dXBPlS促进dFOXO降解的作用没有明显影响,而MGl32仍能够使dXBPls促进dFOXO蛋白的降解得到一定程度的逆转(图7B)。
这些数据表明dXBPls促进dFOXO降解的作用与胰岛素途径没有明显的关联,该过程主要依赖于蛋白酶体而不是胰岛素途径。
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图7蛋白免疫印记法检测蛋白水平变化实验。
(A)Insulin(10ug/m1)处理S2细胞后,dXBPls和dFOXO的蛋白表达水平。
(B)MGl32(20uM/L),Insulin共同处理S2细胞后dXBPls和dFOXO的蛋白表达水平。
Fig.7TheeffectofinsulintreatmentonthedegradationofdFOXO.(A)TheactivationofinsulinsignalingpathwaydidnotaffectthedegradationofdFOXOinducedbydXBP1s.(B)ThedegradationofdFOXOinducedbydXBP1swasdependentonproteasomeratherthaninsulinsignalingpathway.
3沉默dFoxO能够使dXbpl敲低果蝇的表型得以恢复
我们进行了一系列沉默dFoxO基因对dXbpl敲低造成表型的恢复实验,尼尔红染色实验结果表明,在正常喂
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