RocheLightCycler480中文操作说明.docx
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RocheLightCycler480中文操作说明
LightCycler®480中文操作说明
罗氏医学仪器公司/应用科学部门
February2008
一.启动机器与软件
3
二.软件设定---开启新实验
5
三.样品编辑
9
四.结果分析
12
五.报告
18
六.数据转移至其它计算机(数据输出与输入)
19
七.使用者管理
19
一.启动机器与软件
∙启动机器
1.机器主开关位于机器右后方。
2.机器正面两个警示灯代表机器状态。
待警示灯(右)由闪烁橘色灯转变成稳定橘色灯,警示灯(左)由橘色转变成绿色(约三分半钟),表示机器已经启动完成。
左警示灯
右警示灯
机器状态
橘*闪烁*
橘*闪烁*
正在初始化
绿
橘
机器启动完成
96/384孔盘还未放入
绿
橘*闪烁*
96/384孔盘正在放入中
绿
绿
机器启动完成
96/384孔盘已经放入
绿*闪烁*
绿*闪烁*
实验进行中
3.按压机器正面上唯一的按钮,放入已经封膜完成之96或384孔盘。
放置完成后,左右两警示灯都呈现绿色。
∙启动软件
1.开启计算机,并以正确的使用者名称与密码登入Windows。
Username:
OPERATOR
Password:
LC480
2.开启LightCycler480软件,并输入正确的使用者与密码。
二.软件设定--开启新实验
∙设定新实验
1.软件开启后,会进入主画面。
点选“NewExperiment”。
2.出现实验设定窗口。
任何时候需要回主画面的话,点选画面右边的按钮。
∙设定实验
v若要套用设定好的实验步骤(Template),请跳至6.。
1.在实验设定画面上方,先选择适当的DetectionFormat。
选项包含:
另外可再点选“Customize”勾选所需的滤片组合。
2.输入反应体积:
96wellplate范围为10-100ul,而384wellplate范围为5-20ul。
3.设定实验步骤(Program)
∙设定program,包含有Pre-incubation,Amplification(PCR),Meltingcurve(optional)与Cooling。
利用『+』与『-』增加或删除步骤。
∙设定循环数目(Cycle)与分析模式。
通常Amplification(PCR)program设定成『Quantification』,而MeltingCurveprogram设定成『MeltingCurve』。
4.设定详细温度变化(依照不同实验方法与设计而有所不同)
∙点选各个program即可设定详细温度变化步骤,请根据产品说明书来设定,利用『+』与『-』增加或删除步骤。
需要设定的参数包含Target(℃)目标温度,AcquisitionMode(荧光侦测模式),Hold(hh:
mm:
ss)停留时间。
RampRate(℃/s)为升降温速度,范围如下:
RampRate(℃/s)
Heatingup
Coolingdown
96-wellBlock
1.0–4.4℃/s
1.0–2.2℃/s
384-wellBlock
1.0–4.8℃/s
1.0–2.5℃/s
v若设定温度低于50℃,请把RampRate调整成1.5℃/s(96well)或2.0℃/s(384well)。
5.将实验步骤储存成『Template』以便下次进行套用。
点选左下角“SaveAsTemplate”即可把此步骤储存起来。
6.若要进行套用时,请直接点选窗口左下角“ApplyTemplate”,选择欲套用之实验步骤即可。
7.设定完成后点选“StartRun”开始进行实验。
8.跳出档案储存窗口,请输入欲储存之文件名称。
v实验进行中会进入另一个Data窗口,窗口下方按键功能如下:
✓EndProgram:
结束此Program,进入下一个Program。
✓+10Cycles:
实时增加循环数目。
✓AbortRun:
马上结束此实验,请注意,若按此键,则此次实验的结果将不储存。
三.样品编辑
∙将样品分群
1.点选窗口左边的“SubsetEditor”。
2.点选“New”新增新的群组,并将其命名。
3.利用鼠标选取此群组之样品位置,点选窗口右下角“Apply”,此时被选取的样品位置会呈现实心的蓝色,如下图。
4.以此方式依序将所有样品群组编辑完毕。
v样品必须分群才能够独立分析,但是样品是否分群并不影响样品的Cp值。
∙编辑样品名称
1.点选窗口左边的“SampleEditor”。
2.输入每个位置之样品名称(Name)与重复(Repl.Of)。
3.若要更快速输入,可直接在左边的图上点选欲编辑之样品:
v若A1,A2与A3为三重复,在A2与A3Repl.Of字段上都填上A1即为三重复。
v在编辑过程中,可利用『Ctrl』+『C』复制文字,『Ctrl』+『V』贴上文字。
4.根据实验分析模式,编辑AbsQuant(绝对定量),RelQuant(相对定量),或Genotyping分页,设定SampleType。
绝对定量(AbsQuant):
『Unknown』:
未知浓度样品
『Standard』:
已知浓度标准品
相对定量(RelQuant):
『Target』:
目标基因
『Reference』:
参考基因
『Calibrator』:
Control样品
『Standard』:
已知浓度的样品
『Unknown』:
未知浓度样品
v其它分析模式之分页在此不赘述,请自行参考LightCycler480InstrumentOperator’sManual。
5.若设定成『Standard』之样品请输入浓度。
6.若想要将此样品编辑储存成Template,可点选窗口左下角“SaveAsTemplate”即可,下次实验时可点选“ApplyTemplate”进行套用。
四.结果分析
∙点选左边的“Analysis”,选取分析模式,并选择所需分析之群组,如下图:
1.
分析模式
说明
AbsQuant/2ndDerivativeMax
绝对定量(自动法)
AbsQuant/FitPoints
绝对定量(手动法)
ColorCompensation
色差校正(多色实验校正用)
GeneScanning
基因扫描(适用于HighResolutionMeltingCurve,HRM分析)
Genotyping
基因分型(适用于HybProbe之基因分型实验)
RelativeQuantification
相对定量
TmCalling
Tm分析
∙绝对定量(AbsoluteQuantification)
1.点选下方的“Calculate”即可得到样品之Cp与标准曲线。
重複樣品平均後之Cp值與濃度,並自動計算標準差
2.数值之数据输出:
在数值分析表上按鼠标右键,点选“Export”即可输出成.txt档案格式。
可直接以MicrosoftExcel软件开启。
3.图形输出:
在图形上按鼠标右键,点选“Export”即可输出成各种图形档案格式。
4.标准曲线储存:
点选窗口下方StdCurve之“Saveasexternal”,输入适合档名后即可储存在数据库中。
∙相对定量(RelativeQuantification)
1.在选择相对定量分析后,出现下面窗口:
vReferenceSampleLocation:
若Reference(Housekeepinggene)之样品在同一盘上请选择“In-Run”,否则请选择“External”可输入另一次实验的数据一起分析。
v建议将AutoPair打勾让计算机自动将样品配对。
2.进入『Target』与『Reference』分页,右下角显示“Eff=2”表示将目标基因与参考基因的PCR效率以2.0来计算。
3.若需要校正目标基因与参考基因之PCR效率,则需要输入标准曲线。
在『Target』与『Reference』分页之右下角,输入(import)标准曲线。
vUseinrun:
输入(import)同一盘上之标准曲线。
vUseexternal:
输入(import)之前已储存于数据库中之标准曲线。
4.点选『Pairing』分页,检查计算机自动配对结果是否正确。
其中,红色表示Unknown样品,绿色表示Calibrator样品。
若欲外加配对,则可直接以鼠标点选样品后按“Add”即可增加配对。
5.点选『Results』分页,点选“Calculate”即可得到计算结果。
6.数值和图形输出与绝对定量相同。
(请参考绝对定量)
∙基因分型(Genotyping)
1.进入基因分型的窗口中。
2.窗口右下角可设定分类方式
vAutoGroup:
自动分组
vIn-run:
标准品包含在本次实验中
vExternal:
标准品在之前已储存之实验中
3.点选“Calculate”即可得到分型结果。
∙Tm分析(TmCalling)
1.进入Tm分析窗口
2.确认波峰数目
3.选择检测模式
4.点选“Calculate"即可得到每个样品之Tm值。
五.报告(Report)
1.将分析后结果储存后即可点选报告键。
数据储存
报告
2.勾选想要呈现的报告内容。
3.点选“Generate”即可产生报告。
4.点选“PDF”即可将此报告储存成.pdf档案格式。
六.数据转移至其它计算机(数据输出与输入)
∙数据输出
1.点选
(navigator)
2.点选所要输出的实验档案,点选
即可将档案输出成.ixo档案
3.将此ixo档案以光盘或随身碟存到另一计算机
∙数据输入
1.分析计算机上开启LightCycler480软件,登入后点选
2.点选
,选取所要输入的.ixo档案并开启,即可开始进行实验数据分析
3.点选
将此实验档案储存至数据库中
七.使用者管理
1.点选右方工具键。
2.点选“UserandGroups”。
3.点选“New”即可新增使用者,并设定使用者名称、密码与权限。
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