二食品添加剂的通用名称功能分类用量和使用范围通用名称.docx
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二食品添加剂的通用名称功能分类用量和使用范围通用名称
(二)食品添加剂的通用名称、功能分类、用量和使用范围
1.通用名称
通用名称
来源a
供体b
果胶裂解酶
Pectinlyas
里氏木霉
Trichodermareesei
黑曲霉
Aspergillusniger
本文叙述的果胶裂解酶是通过里氏木霉发酵生产的,该里氏木霉携带有来自黑曲霉的果胶裂解酶编码基因。
2.功能分类
果胶裂解酶收录于GB2760-2014食品添加剂使用标准中,为允许使用的食品用酶制剂,其来源的微生物为黑曲霉。
本次申报的果胶裂解酶来源于里氏木霉,该菌种未收载在GB2760-2014规定的果胶裂解酶来源的微生物名单中。
因此,特申请里氏木霉来源的果胶裂解作食品用酶制剂新品种。
3.使用量和使用范围
食品分类号
食品名称
最大使用量
(mg/kg)
备注
14.02
果蔬汁类及其饮料
按生产需要适量使用
15.03.03
果酒
按生产需要适量使用
04.01.02.06
果泥
按生产需要适量使用
15.03.01
葡萄酒
按生产需要适量使用
依据现行良好生产规范(GMP)要求,建议以达到预期效果的最小添加量使用该酶。
(三)证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件
㈠食品添加剂的功能类别、作用机理
1、功能类别
本次申报的果胶裂解酶功能为食品用酶制剂,主要用于果蔬汁类及其饮料、果酒、果泥、葡萄酒的加工。
我国食品添加剂国家标准GB2760-2014已收载来源于黑曲霉的果胶裂解酶,并广泛应用在食品加工中。
但ABEnzymesGmbH出品的果胶裂解酶来源于里氏木霉,与GB2760-2014规定的果胶裂解酶菌种来源不同,因此特申请里氏木霉来源的果胶裂解酶作为食品用酶制剂。
2、作用机理
果胶酶是一类分解果胶物质的酶的总称。
常见的果胶酶有三种:
果胶裂解酶(PL)、果胶甲基酯酶(PE)及多聚半乳糖醛酸酶(PG)。
果胶的分解可通过两种不同的机理实现:
PE/PG模式和PL模式。
果胶结构及果胶酶的作用如下图示:
⑴PE/PG模式
果胶甲基酯酶(PE)可随机切除甲酯化果胶中的甲基产生甲醇和游离羧基,该过程对于果胶溶液的粘度几乎没有影响。
多聚半乳糖醛酸酶(PG)能切断果胶酸的α-1,4糖苷键,促进聚半乳糖醛酸链水解。
PG酶根据水解机理分为内切酶及外切酶两种,内切酶从分子内部无规则的切断α-1,4糖苷键,可使果胶粘度迅速下降;外切酶从分子末端逐个切断α-1,4糖苷键,粘度下降不明显。
PE酶去甲酯化,是PG酶继续作用进一步分解果胶链的前置条件。
因此,PE、PG酶是复配作用的。
果胶甲基酯酶(PE)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)共同作用,称之为PE/PG模式。
首先由果胶甲基酯酶去除甲基,形成果胶酸及游离的甲醇;然后多聚半乳糖醛酸酶进一步作用将果胶酸分解成小分子,最终达到将果胶大分子分解成小分子的作用。
该过程产生的游离甲醇会残留在最终成品中。
对于果胶含量高或者酯化度高的果蔬品种,比如红枣、山楂、蓝莓等,控制成品的甲醇含量成为一个难题。
市场上的果胶分解酶基本上都是此种类型。
⑵PL模式
果胶裂解酶通过反式消去作用切割α-1,4糖苷键,在半乳糖醛酸的非还原末端形成C4和C5不饱和键。
果胶裂解酶是唯一通过反式消去作用降解高酯化果胶的果胶酶,而不需要果胶酯酶的酯化作用。
ABEnzymesGmbH出品的果胶裂解酶即为该类型,其对果胶的分解是在没有预先去酯的情况下,以反式消去的模式进行,可快速降低粘度,不会产生甲醇和半乳糖醛酸。
㈡里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶的使用效果比较
1、里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶在果蔬汁及其饮料中的使用效果对比资料
与黑曲霉(包括重组黑曲霉)来源的果胶裂解酶相比,本品有诸多优势(具体试验报告见附件1),如下:
⑴作用时间更短,可以更快的降低果汁粘度,加快过滤速度,提高出汁率及产品澄清度,特别适用于需要快速降低粘度的产品加工(如橙汁加工);
⑵使用本品的产品具有更好的压榨性能,缩短了加工时间,有效提高了生产能力,有利于降低生产成本、提高生产效益;
⑶使用本品的产品中甲醇的含量更低;
⑷使用本品的产品具有更好的质量稳定性,有效延长了保质期。
表1不同来源的果胶裂解酶在果汁中的应用效果对比
指标
果胶裂解酶
(里氏木霉)
果胶裂解酶
(黑曲霉)
酶活性
酶作用机理
反式消去作用
反式消去作用
作用条件要求
作用条件更宽
(pH值:
3.0-6.0)
比较有限
(pH值:
3.0-4.5)
作用速度
(粘度降至30%)
<30秒
≥210秒
产品质量
粘度
(作用时间30s内)
降至初始水平的27%
降至初始水平的78%
出汁率
93.5%
92%
甲醇含量
0.2-0.3%
1.5-2.0%
NTU(12°BX)
0.78
2.6
透光率(榨机出来的浊汁)
60%
50%
稳定性
浊度变化(NTU)
+0.38
+1.0
色值变化
(37℃保温7天)
-40%
-50%
保质期
3年
2年
生产能力
榨机充填量(吨/时)
13-14
10-12
产能(吨/时)
9
8
能耗
更低
普通
2、里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶在果酒中的使用效果对比资料
略,涉及保密内容。
3、里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶在果泥中的使用效果对比资料
略,涉及保密内容。
4、里氏木霉来源的果胶裂解酶与黑曲霉来源的果胶裂解酶在葡萄酒中的使用效果对比资料
略,涉及保密内容。
㈢在拟添加的食品中添加与否的效果对比
略,涉及保密内容。
㈣本品给食品加工业带来的进步性变化
作为世界四大酶制剂之一,果胶裂解酶已被广泛应用于果蔬加工、酿酒、茶与咖啡发酵、榨油以及天然产物的提取等食品行业中。
作为食品用酶制剂,果胶裂解酶可以快速降解果胶物质,降低原料加工难度、提高营养价值、改善产品质量及贮藏稳定性。
食品工业作为中国国民经济的支柱产业之一,随着其持续、快速的发展,果胶裂解酶的市场空间迅猛增长,需求巨大。
但是,目前国内食品级果胶裂解酶主要来源于黑曲霉,来源单一、产率低、活性有限等问题已成为制约其产业化及应用的技术瓶颈之一,产量和功能远远不能满足国内日益增长的食品工业市场需求。
作为世界上最早成立(1907年)且最为知名的酶制剂公司之一,ABEnzymesGmbH自1990年就开始了果胶裂解酶的研究。
研究发现里氏木霉具有表达量大、胞外蛋白质分泌率高和无毒、无害等特性,是理想的异源重组蛋白表达宿主。
公司利用基因工程技术,构建了高效的果胶裂解酶分子改良和表达技术体系,实现了黑曲霉果胶裂解酶基因在里氏木霉菌株的高效、安全表达,不仅拓展了果胶裂解酶的安全来源、提高了酶活性,同时降低了生产能耗和成本,有利于提高其市场竞争力,推动果胶酶产业的发展,从而满足食品工业的巨大需求。
㈤国外批准使用现状
如本文所述,里氏木霉来源(包括转基因)的果胶酶已得到国际食品界认可。
澳新食品标准局已批准里氏木霉来源的果胶酶作为食品加工助剂使用,参见《澳大利亚新西兰食品标准法典》第1.3.3条-加工助剂,网址如下:
https:
//www.legislation.gov.au/Details/F2012C00064。
本次申请的果胶裂解酶(源于里氏木霉),已于2000年4月通过美国FDAGRAS认证(http:
//www.fda.gov/downloads/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/NoticeInventory/ucm265974.pdf),作为无需限制使用的安全食品添加剂,用于果蔬、谷物和咖啡等的加工。
以本品为主要成分的果胶裂解酶制剂自1995年开始在欧洲各地销售,自2000年开始在美国销售,现已得到广泛的安全性应用,深受食品加工业的普遍欢迎,年销售收入达8千万人民币,客观证明了果胶裂解酶在食品生产中的安全、有效和广泛需求。
迄今为止,尚未发现任何与安全有关的案例。
另外,本品果胶裂解酶已向欧盟委员会递交申请,作为食品酶制剂用于果蔬、果酒、咖啡以及谷物加工,预计在年内将获得欧盟批准上市。
鉴于中国巨大的市场潜力,本公司特向中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会递交申请,批准其作为食品用酶制剂用于果蔬、葡萄酒等的加工。
㈥产品已发表的相关文献
Olempska-Beer等人[1](2006)在发表的文章中,对本次申请的果胶裂解酶的批准状况进行了综述。
(四)质量规格要求、生产使用工艺和检验方法,食品中该添加剂的检验方法或者相关情况说明
㈠质量规格编制说明
1、标准编制依据
本果胶裂解酶产品的质量规格符合联合国粮农组织和世界卫生组织的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和美国食品化学制品药典(FCC)关于食品用酶制剂的的规定,同时也符合我国关于食品用酶制剂的相关要求。
产品质量规格的制定主要参考了以下国际/国内标准:
①JECFA:
食品加工用酶制剂通用标准;
②FCC第7版:
酶制剂的一般要求和额外要求;
③GB25594-2010《食品安全国家标准食品工业用酶制剂》;
④卫生部2009年11号公告:
关于公布食品添加剂新品种的公告(果胶裂解酶)。
质量规格中酶活性的检验方法按照附录A的方法执行。
2、与国际组织和其他国家(地区)相关标准的比较
目前,国际上还没有以该重组里氏木霉为来源的果胶裂解酶产品的相关标准,因此没办法做对比。
㈡质量规格要求
名称:
果胶裂解酶Pectinlyase
来源:
里氏木霉Trichodermareesei
供体:
黑曲霉Aspergillusniger
1、生产工艺
以转基因里氏木霉生产菌在严格控制的条件下进行液体深层发酵制备而成的果胶裂解酶。
2、性状
棕色液体,产品颜色随批次不同略有不同。
3、技术指标
⑴理化指标
应符合表1规定。
表1理化指标
项目
指标
酶活性/(PTF/mg))≥
100
重金属/(mg/kg)≤
30
铅/(mg/kg)≤
5
砷/(mg/kg)≤
3
真菌毒素
不得检出
备注:
酶活性规格除以上规格外,还可按实际需要执行。
⑵微生物指标
应符合表2规定。
表2微生物指标
项目
指标
菌落总数/(cfu/g)<
50000
大肠菌群/(MPN/g)<
30
沙门氏菌/25g
不得检出
致泻大肠埃希氏菌/25g
不得检出
抗生素活性
不得检出
生产菌
不得检出
附录A吸光光度法测定果胶裂解酶活性
1、适用范围
此方法适用于测量果胶酶中果胶裂解酶的活性。
2、定义
在试验条件下,以每分钟在235nm波长下吸光度增加0.01为1个果胶裂解酶活性单位,通常用PTF/mg来表示。
3、试剂
本方法中所用水为去离子水、超纯水;所用试剂在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂。
⑴柠檬酸磷酸盐缓冲溶液(pH=5.8)
称取35.6g磷酸氢二钠二水合物(Na2HPO4·2H2O),用容量瓶定容至1000mL。
称取21g一水柠檬酸,用容量瓶定容至1000mL。
在测试当天将上述溶液以57:
43的比例混合,检测pH=5.8。
通过添加上述其中一种溶液调整pH值。
⑵0.5%果胶基质溶液
称取5g果胶(哥本哈根果胶)至烧杯中,加入20ml纯乙醇或者96%浓度的乙醇,然后使用电磁搅拌器混合均匀。
缓慢加入(2分钟内)800mL的上述缓冲液,继续搅拌30分钟(不要产生泡沫)。
调节PH值至5.8后,用缓冲液定容至1000mL。
以12000rpmm的速度离心10分钟。
基质在-20℃凝固存储。
在冷冻前应检查溶液吸收率(应该为<2)。
4、仪器和设备
①分析天平
②电磁搅拌器
③分光光度计,如UV-1601
④离心机
5、分析步骤
⑴待测酶液的制备
称取200-500mg样品用柠檬酸磷酸盐缓冲剂稀释,全部移入容量瓶中,定容。
吸光度的变化应为0.01-0.03(理想值为0.02-0.03)每分钟。
在每份样品中准备3份相同的重量。
⑵测定
设置分光光度计相关参数,用水溶液调零。
用移液器吸取3.0ml基质溶液到比色皿中并在30℃下预热15分钟。
然后加入100µl待测酶液,封口,翻转混合。
在235nm波长下测定8分钟内的吸收率变化。
6、计算
在线性范围内(至少长达5分钟)测量吸收率的增加。
△A=吸收率的差异
m=溶液中样品的数量(mg)
t=时间(min)
请知悉:
岛津UV-1601测量△A/t的数值。
上述酶活性检验方法的方法学验证报告详见附件2。
㈢生产工艺
果胶裂解酶的生产工艺,包括发酵、纯化(回收)、配制以及成品的质量控制。
本节描述本产品生产中所应用的各种生产工艺。
注:
1.流程控制图中的控制步骤可能会根据生产过程中产品生产计划而有所变动。
2.微生物控制:
通过显微镜和平板计数确保无微生物污染。
3.发酵过程中的参数例如pH、温度、氧气、二氧化碳、无菌空气的流通是受监测的。
4.后处理过程中的操作控制包括监测和控制参数例如pH、温度控制以达到质量评价中释放的标准。
5.检验产品是否符合质量标准。
1、发酵
果胶裂解酶是通过转基因里氏木霉深层发酵制备生产的。
⑴发酵原料
只有检验合格的原料才可用于生产。
发酵工艺(种子培养、种子罐、主发酵及补料)中所使用的原料如下所列:
●饮用水
●碳源
●氮源
●盐类和矿物质(硫酸铵、磷酸二氢钾)
●pH调节剂
●泡沫控制剂
⑵发酵环境的控制
所有设备均经过谨慎的设计与构建,以阻止外源微生物的污染。
所有发酵工艺中未使用的阀门和连接装置,均在120℃以上的蒸汽中密封保存。
高压灭菌后,发酵罐内维持一定的正压力。
将通气用空气通过无菌过滤器,对其进行灭菌。
在每个发酵工艺前,清洗每个发酵罐的内侧。
所有发酵罐、容器和管道使用后用在线清洁系统(CIP)进行冲洗,并在清洗过程完成后进行检查。
⑶菌种保藏
生产菌株的培养物在甘油中于-80℃保存。
接种之前,生产菌株的原种培养物按照下列参数进行质量控制:
菌种确认、无污染微生物、活菌计数、产酶能力。
⑷接种物
将生产菌的培养物混悬液以无菌方式转移到含发酵培养基的摇瓶中。
为了获得足够的生物量,重复该流程数次。
获得足够的生物量之后,合并摇瓶内容物用于接种种子发酵罐。
⑸种子发酵
接种物以无菌方式转移到试点发酵罐中,随后再转移到种子发酵罐中。
在恒定的温度和固定的pH下进行种子发酵。
⑹主发酵
种子发酵罐培养物经无菌操作转移至主发酵罐中,通过标准的深层发酵法在主发酵罐中进行发酵。
在主发酵过程中,生产菌株进行果胶裂解酶的生物合成。
发酵流程应该持续到预定的时间,或者直到实验室检测数据显示已经获得理想的酶产量或者酶的生产速率已经降低到预定的生产速率以下。
满足这些条件时,发酵结束。
主发酵的控制参数如表3所示。
表3主发酵罐
工艺操作
控制参数
操作
培养基
培养基灭菌
蒸汽喷射灭菌(121°C,至少20分钟)
灭菌后分析
测量pH值,需要时调节pH值
发酵
温度
在明确的温度下发酵
通气
培养基由灭菌空气通气
压力
保持发酵罐中的正压力
pH值
控制并调节
CO2
始终检测
分析
pH值每隔一段时间测定一次
酶活力
每隔一段时间测定一次
微生物分析
在接种之前和发酵过程中,样品要严格控制
微生物控制步骤中,必须控制外源性微生物的量。
从种子发酵罐和主发酵罐中取样(接种之前、培养过程中定期、转移或收集之前),进行显微镜检查或平板计数分析。
同时密切监测相关发酵参数,如酶活力和pH值,偏离正常的发酵工艺可能意味着有染菌。
2、回收
回收的目的在于从发酵液中分离出所需要的酶,然后对酶进行纯化、浓缩。
本工艺步骤包括一系列单元操作,包括预处理、固液分离、浓缩、抛光和细菌过滤。
不同酶生产厂家,该单元操作的性质、数量和顺序可能各不相同。
⑴回收原料
回收工艺中所使用的原料如下所列:
•絮凝剂
•助滤剂
•pH调节剂
回收流程中除了上述材料之外还可以使用饮用水。
⑵预处理
如果需要时,可加入絮凝剂或助滤剂以方便初步分离过程。
助滤剂的用量通常为2.5%。
⑶固液分离
通过离心或过滤等技术,将细胞群和其他固形物从发酵液中分离去除。
工艺中使用的助滤剂为食品级硅藻土。
在规定的pH和温度范围内进行固液分离,以便最大限度地减少酶活性的损失。
⑷浓缩
使用超滤和蒸发对酶进行浓缩和进一步纯化,以获得期望的酶活性、增加活力/干物质比。
在浓缩过程对温度和pH进行控制,直到获得所需的浓度。
⑸抛光和细菌过滤
为了去除残留的生产菌并作为一般性的防微生物降解措施,使用专用的微生物过滤器进行过滤。
预过滤(抛光过滤)为可选项,可用于清除不溶性杂质并促进细菌过滤。
该单元操作可以去除生产菌及其他来自发酵的不溶性杂质。
3、配制和包装
依据产品质量标准,配制标准化酶制剂产品。
4、产品控制
分析每批产品以确保果胶裂解酶制剂的质量。
产品控制标准包括pH、酶活性、微生物纯度等。
㈣该食品添加剂在食品中的生产使用工艺
根据不同食品生产工艺和工序使用该酶制剂。
下面给出了果胶裂解酶用于果蔬汁、葡萄酒、果酒、果泥加工过程的工艺流程图供参考。
1、果胶裂解酶在果蔬汁中的生产使用工艺
果胶裂解酶及其它果胶酶的复合酶制剂通常用于果蔬加工。
在对原料进行处理时,可用于果实脱皮;在处理果浆时,可有效降低黏度、改善压榨性能,提高出汁率和营养成分含量;在进行沉淀、过滤和离心时,可破坏果汁中悬浮的稳定性,提高超滤的通量,缩短超滤时间,降低非酶褐变,稳定果汁,保证良好的贮存稳定性和质量要求。
由于果胶裂解酶可避免甲醇的产生,也可避免部分脱酯的果胶同钙离子形成沉淀,还可避免构成各种水果芳香性成分的酯类物质的损失,所以果胶酶制剂若用于果蔬汁和果酒加工,最好含有较多量果胶裂解酶。
2、果胶裂解酶在葡萄酒酿造过程中的生产使用工艺
复合果胶酶是现代葡萄酒酿造中的重要辅料,包括果胶裂解酶、果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酯酶等。
在复合果胶酶的作用下,可促进葡萄汁澄清、果香浸提和颜色浸渍,对葡萄酒品质的改善和提升起到显著效果。
在葡萄酒酿造过程中使用果胶裂解酶的主要作用:
⑴提高澄清度及过滤通透性
通常,葡萄中含有的大量果胶会导致澄清困难、出汁率低、过滤效率低等问题。
同时,在浸渍过程中,这些存在于葡萄皮和果肉中的大量果胶会阻碍色素和单宁的浸渍、溶解和稳定,从而增加葡萄酒酿造的难度。
在适当工艺阶段添加果胶裂解酶后,果胶将被彻底分解,使过滤和澄清更容易,同时大大提升出汁率,从而提高自流汁产量。
同时,因为澄清速度加快,葡萄汁与固形物接触的时间减少,进一步降低了葡萄酒出现某些不良气味的风险。
⑵提高多酚物质的浸出率
使用果胶裂解酶,不但可以加速色素和单宁的浸渍溶解,而且可以增强葡萄酒色素和单宁的稳定性,提高葡萄汁中有益颜色和风味成分的含量,进而改善葡萄酒的呈色质量。
3、果胶裂解酶在果酒中的生产使用工艺
4、果胶裂解酶在果泥的生产使用工艺
在果泥生产过程中,果胶裂解酶通常和维生素C在破碎或打浆、籽皮分离、均质前添加,可快速降低果浆粘度、防止浓缩时果泥和浓缩果汁的凝胶化、提高产品得率。
㈤食品中该酶制剂检验方法的情况说明
果胶裂解酶作为食品用酶制剂,在食品加工过程中发挥其功能作用。
在最终产品中,果胶裂解酶制剂或因过滤、高温、蒸馏等工序被除去或失去活性,或者存在但不执行任何功能作用,这与其他酶制剂的情况一致,所以将无法在最终的食品测到该酶。
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