沙门氏菌检测.docx
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沙门氏菌检测
沙门氏菌检测
1设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
1.1冰箱:
2°C〜5°C。
1.2恒温培养箱:
36C±C,42C±C。
1.3均质器。
1.4振荡器。
1.5电子天平:
感量0.1g。
1.6无菌锥形瓶:
容量500ml,250ml。
1.7无菌吸管:
1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)或微量移液器及吸头。
1.8无菌培养皿:
直径90mm。
1.9无菌试管:
3mm<50mm、10mm<75mm。
1.10无菌毛细管。
1.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。
1.12全自动微生物生化鉴定系统。
2培养基和试剂
2.1缓冲蛋白胨水(BPW):
见附录中1。
2.2四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:
见附录中2。
2.3亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:
见附录中3。
2.4亚硫酸铋(BS)琼脂:
见附录中4。
2.5HE琼脂:
见附录中5。
2.6木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:
见附录中6。
2.7沙门氏菌属显色培养基。
2.8三糖铁(TSI)琼脂:
见附录中7。
2.9蛋白胨水、靛基质试剂:
见附录中&
2.10尿素琼脂(pH7.2):
见附录中9。
2.11氰化钾(KCN)培养基:
见附录中10。
2.12赖氨酸脱羧酶试验培养基:
见附录中11。
2.13糖发酵管:
见附录中12。
2.14邻硝基酚0D半乳糖苷(ONPG)培养基:
见附录中13。
2.15半固体琼脂:
见附录中14。
2.16丙二酸钠培养基:
见附录中15。
2.17沙门氏菌O和H诊断血清。
2.18生化鉴定试剂盒。
3操作方法
3.1试验前准备
3.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管(1ml、10ml)、稀释剂等移至操作室内。
准备好足够用量,避免操作中出入操作间。
3.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。
3.1.3操作人员用肥皂洗手,关闭紫外杀菌灯,进入缓冲间,换工作鞋,用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手,穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。
3.1.4操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面,再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围,待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。
3.2前增菌
称取25g(ml)样品放入盛有225mlBPW的无菌均质杯中,以8000r/min〜10000r/min均质1min〜2min,或置于盛有225mlBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min〜2min。
若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。
如需测定pH值,用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.8±.2。
无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中,如使用均质袋,可直接进行培养,于36°C±°C培养8h〜18h。
如为冷冻产品,应在45C以下不超过15min,或2C〜5C不超过18h解冻。
3.3增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1ml,转种于10mlTTB内,于42C±C培养18h〜24h。
同时,另取1ml,转种于10mlSC内,于36C±1C培养18h〜24h。
3.4分离
分别用接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。
于36C±1C分别培养18h〜24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板)或40h〜48h
(BS琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落。
各个平板上的菌落特征见表1
表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
沙门氏菌
BS琼脂
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。
HE琼脂
蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。
XLD琼脂
菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心。
沙门氏菌属显色培养基
按照显色培养基的说明进行判定。
3.5生化试验
3.5.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36C±C培养18h〜24h,必要时可延长至48h。
在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。
表2沙门氏困属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂
赖氨酸脱羧酶试验培养基
初步判断
斜面
底层
产气
硫化氢
K
A
+(—)
+(—)
可疑沙门氏菌属
K
A
+(—)
+(—)
一
可疑沙门氏菌属
A
A
+(—)
+(—)
可疑沙门氏菌属
A
A
+/—
+/—
一
非沙门氏菌
K
K
+/—
+/—
+/—
非沙门氏菌
注:
K:
产碱,A:
产酸,+:
阳性,一:
阴性;+(—)多数阳性,少数阴性;+/—:
阳性或阴性。
3.5.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水
(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。
于36±°C培养18h〜24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。
将已挑菌落的平板储存于2C〜5C或室温至少保留24h,以备必要时复查。
表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应序
号
硫化氢(H2S)
靛基质
pH7.2尿素
氰化钾(KCN)
赖氨酸脱羧酶
A1
+
—
—
—
A2
—
—
+
A3
—
—
—
—
+/—
注:
+:
阳性,一:
阴性,+/—:
阳性或阴性。
3.521反应序号A1:
典型反应判定为沙门氏菌属。
如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。
如有2项异常为非沙门氏菌。
表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2尿素
氰化钾(KCN)
赖氨酸脱羧酶
判定结果
—
—
—
甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结
果)
—
沙门氏菌IV或V(要求符合本群生化特
性)
—
沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结
果)
注:
+:
阳性,一:
阴性。
3.522反应序号A2:
补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
3.5.2.3反应序号A3:
补做ONPG。
ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性。
甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
3.5.2.4必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5沙门氏菌属各生化群的鉴别
项目
I
II
III
IV
V
VI
卫矛醇
+
+
—
—
+
—
山梨醇
—
水杨苷
—
—
—
—
—
ONPG
—
—
—
—
丙二酸盐
—
—
—
—
KCN
—
—
—
—
注:
+:
阳性,一:
阴性。
3.5.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据3.5.1的初步
判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
3.6血清学鉴定
3.6.1抗原的准备
一般采用1.2%〜1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O血清不凝
集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如2%〜3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%〜0.65%半固体琼脂平板的中央,俟菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有0.3%〜0.4%半固体琼脂的小玻管1次〜2次,自远端取菌培养后再检查。
3.6.2多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出2个约1cmK2cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区
域下部加入1滴生理盐水,作为对照。
再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。
将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
3.6.3多价鞭毛抗原(H)鉴定同362。
3.7结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(ml)样品中检出或未检
出沙门氏菌。
附录培养基和试剂
1缓冲蛋白胨水(BPW)
1.1成分
蛋白胨
10.0g
氯化钠
5.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水)磷酸二氢钾
9.0g
1.5g
蒸馏水
1000ml
pH
1.2制法
7.2±0.2
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH,高压灭菌121C,15min。
2四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
2.1基础液
蛋白胨
10.0g
牛肉膏
5.0g
氯化钠
3.0g
碳酸钙
45.0g
蒸馏水
1000ml
pH
7.0±0.2
除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH,高
压灭菌121C,20min。
2.2硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠(含5个结晶水)
50.0g
蒸馏水
高压灭菌121C,20min。
2.3碘溶液
加至100ml
碘片
20.0g
碘化钾
25.0g
蒸馏水加至100ml
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。
2.40.5%煌绿水溶液
煌绿0.5g
蒸馏水100ml
溶解后,存放暗处,不少于Id,使其自然灭菌。
2.5牛胆盐溶液
牛胆盐10.0g
蒸馏水100ml
加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121C,20min
2.6制法
基础液
900ml
硫代硫酸钠溶液
100ml
碘溶液
20.0ml
煌绿水溶液
2.0ml
牛胆盐溶液
50.0ml
临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种成分。
3亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
3.1成分
蛋白胨
5.0g
乳糖
4.0g
磷酸氢二钠
10.0g
亚硒酸氢钠
4.0g
L-胱氨酸
0.01g
蒸馏水
1000ml
pH
7.0±0.2
3.2制法
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55C以下,以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10ml(称取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液15ml,使溶解,再加无菌蒸馏水至100ml即成,如为DL-
胱氨酸,用量应加倍)。
摇匀,调节
pH。
4亚硫酸铋(BS)琼脂
4.1成分
蛋白胨
10.0g
牛肉膏
5.0g
葡萄糖
5.0g
硫酸亚铁
0.3g
磷酸氢二钠
4.0g
煌绿
0.025g或5.0g/L水溶液5.0ml
柠檬酸铋铵
2.0g
亚硫酸钠
6.0g
琼脂
18.0g〜20g
蒸馏水
1000ml
pH
7.5±0.2
4.2制法
将前三种成分加入300ml蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20ml和30ml蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20ml和30ml蒸馏水中,琼脂加入600ml蒸馏水中。
然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。
冷至80°C左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。
将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。
调节pH,随即倾入琼脂液中,
混合均匀,冷至50C〜55C。
加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:
本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48h会降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用<
5HE琼脂(HektoenEntericAgar)
5.1成分
蛋白胨12.0g
牛肉膏
3.0g
乳糖
12.0g
蔗糖
12.0g
水杨素
2.0g
胆盐
20.0g
氯化钠
5.0g
琼脂
18.0g〜20.0g
蒸馏水
1000ml
0.4%溴麝香草酚蓝溶液
16.0ml
Andrade指示剂
20.0ml
甲液
20.0ml
乙液
20.0ml
pH
7.5±0.2
5.2制法
将前面七种成分溶解于400ml蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600ml
蒸馏水内。
然后分别搅拌均匀,
煮沸溶解。
加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。
再加入指示剂,并与琼脂液合并
,待冷至50C〜55C倾注平皿。
注:
①本培养基不需要高压灭菌,
在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择
性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠
34.0g
柠檬酸铁铵
4.0g
蒸馏水
100ml
③乙液的配制
去氧胆酸钠
10.0g
蒸馏水
100ml
④Andradef旨示剂
酸性复红
0.5g
1mol/L氢氧化钠溶液
16.0ml
蒸馏水100ml
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。
数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1ml〜2ml。
6木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
6.1成分
酵母膏
3.0g
L-赖氨酸
5.0g
木糖
3.75g
乳糖
7.5g
蔗糖
7.5g
去氧胆酸钠
2.5g
柠檬酸铁铵
0.8g
硫代硫酸钠
6.8g
氯化钠
5.0g
琼脂
15.0g
酚红
0.08g
蒸馏水
1000ml
pH
7.4±0.2
6.2制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400ml蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。
另将琼脂加入600ml蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至50C〜55C倾注平皿。
注:
本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。
本培养基宜于当天制备,第二天使用。
7三糖铁(TSI)琼脂
7.1成分
20.0g5.0g
10.0g
蛋白胨牛肉膏乳糖
硫酸亚铁铵(含6个结晶水)
0.2g
酚红
0.025g或5.0g/L溶液5.0ml
氯化钠
5.0g
硫代硫酸钠
0.2g
琼脂
12.0g
蒸馏水
1000ml
pH
7.4±0.2
1.0g
葡萄糖
7.2制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400ml蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。
另将琼脂加入600ml蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约2ml〜4ml,高压灭菌121°C10min或115°C15min,
灭菌后置成高层斜面,呈桔红色
8蛋白胨水、靛基质试剂
8.1蛋白胨水
蛋白胨(或胰蛋白胨)
20.0g
氯化钠
5.0g
蒸馏水
1000ml
pH
将上述成分加入蒸馏水中,
7.4±0.2
煮沸溶解,调节pH,分装小试管,121C高压灭菌15min。
8.2靛基质试剂
8.2.1柯凡克试剂:
将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸
25ml。
8.2.2欧-波试剂:
将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95%乙醇内。
然后缓慢加入
浓盐酸20ml。
8.3试验方法
挑取小量培养物接种,在36C±C培养1d〜2d,必要时可培养4d〜5d。
加入
柯凡克试剂约0.5ml,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约
0.5ml,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注:
蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。
每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后
方可使用。
9尿素琼脂(pH7.2)
9.1成分
蛋白胨
1.0g
氯化钠
5.0g
葡萄糖
1.0g
磷酸二氢钾
2.0g
0.4%酚红
3.0ml
琼脂
20.0g
蒸馏水
1000ml
20%尿素溶液
100ml
pH
7.2±0.2
9.2制法
除尿素、琼脂和酚红外,将其他成分加入400ml蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。
另将琼脂加入600ml蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂后分装,121C高压灭菌15min。
冷至50C〜55C,加入经除菌过滤的尿素溶液。
尿素的最终浓度为2%。
分装于无菌试管内,放成斜面备用。
9.3试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36C±C培养24h,观察结果。
尿素酶阳性者由于产
碱而使培养基变为红色。
10氰化钾(KCN)培养基
10.1成分
蛋白胨
10.0g
氯化钠
5.0g
磷酸二氢钾
0.225g
磷酸氢二钠
5.64g
蒸馏水
1000ml
20.0ml
0.5%氰化钾
10.2制法
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后121C高压灭菌15min。
放在冰箱内使其充分冷却。
每100ml培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0ml(最后浓度为1:
10000),分装于无菌试管内,每管约4ml,立刻用无菌橡皮塞塞紧放在4C冰箱内,至少可保存两个月。
同时,将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
10.3试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取1环接种于氰化钾
(KCN)培养基。
并另挑取1环接种于对照培养基。
在36°C±°C培养1d〜2d,观察结果。
如有细菌生长即为阳性(不抑制),经2d细菌不生长为阴性(抑制)注:
氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。
夏天分装培养基应在冰箱内进行。
试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。
试验时对每一环节都要特别注意。
11赖氨酸脱羧酶试验培养基
11.1成分
蛋白胨
酵母浸膏
葡萄糖
蒸馏水
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液
L-赖氨酸或DL-赖氨酸
pH
11.2制法
5.0g
3.0g
1.0g
1000ml
1.0ml
0.5g/100ml或1.0g/100ml
6.8±0.2
除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100ml,分别加入赖氨酸。
L-赖氨酸按0.5%加入,DL-赖氨酸按1%加入。
调节pH。
对照培养基不加赖氨酸。
分装于无菌的小试管内,每管0.5ml,上面滴加一层液体石蜡,115C高压灭菌10min
11.3试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36C±C培养18h〜24h,观察结果。
氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。
阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。
对照管应为黄色。
12糖发酵管
12.1成分
牛肉膏5.0g
蛋白胨10.0g
氯化钠3.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水)2.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.0ml
蒸馏水1000ml
pH7.4±0.2
12.2制法
12.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后,调节pH。
按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,121°C高压灭菌15min。
12.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100ml,121C高压灭菌15min。
另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。
将5ml糖溶液加入于100ml培养基内,以无菌操作分装小试管。
注:
蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
12.3试验方法:
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36C±C培养,一般2d〜3d。
迟缓反应需观察14d〜30d。
13ONPG培养基
13.1成分
邻硝基酚P-D半乳糖苷(ONPG)60.0mg
0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)10.0ml
1%蛋白胨水(pH7.5)30.0ml
13.2制法
将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于无菌的小试管内,每管0.5ml,用橡皮塞塞紧。
13.3试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36C±C培养1h〜3h和24h观察结果。
如果禺半乳糖苷酶产生,则于1h〜3h变黄色,如无此酶则24h不变色。
14半固体琼脂
14.1成分
牛肉膏
0.3g
蛋白胨
1.0g
氯化钠
0.5g
琼脂
0.35g〜0.4g
蒸馏水
100ml
pH
14.2制法
7.4±0.2
按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH。
分装小试管。
121C高压灭菌15min。
直立凝固备用。
注:
供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。
15丙二酸钠培养基
15.1成分
酵母浸膏
1.0g
硫酸铵
2.0g
磷酸氢二钾
0.6g
磷酸二氢钾
0.4g
氯化钠
2.0g
丙二酸钠
3.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
蒸馏水
12.0ml
1000ml
pH
15.2制法
6.8±0.2
除指示剂以外的成分溶解于水,调节pH,再加入指示剂,分装试管,121°C
高压灭菌15min。
15.3试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种,于36C±C培养48h,观察结果。
阳性者由绿色变为蓝色。
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