第二讲基因工程制药.ppt
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第二章基因工程制药Chapter2GeneEngineeringforPharmacon,第一节、概述,基因工程:
是通过对Nucleicacid分子的Insert,AssembleandRecombinant而实现遗传物质(germplasm)的重新组合,再借助Virus,Bacterium,PlasmidorotherVectors,将Targetgene转移到新的HostCellSystem,并使TargetGene在新的Hostcellsystem进行ReplicationandExpression的技术。
基因工程技术最成功的成就:
用于新型生物技术药物的研制,A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用;B、从动物脏器中提取出来,也因造价太高,或因来源困难而供不应求;C、由于免疫抗原,病毒感染等缘故,使它们在使用上受到限制。
一、传统制药存在的问题:
1、可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质,为临床使用提供有效的保障;可避免免疫抗原性及病毒污染(人生长激素克雅病CJD)2、可以提供足够数量的生理活性物质,以便对其生理生化和结构进行深入的研究,从而扩大这些物质的应用范围;3、利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质;,二、基因工程在生物技术制药中的作用,4、内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处,可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造;IL-2,125半胱氨酸丝氨酸提高活性及稳定性;tPA缩小分子延长半衰期5、利用基因工程技术可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。
6、为新药研发提供了新途径和新技术,极大的提高了药物研发速度,缩短药物研发速度。
7、促进传统制药工业的技术改造,为制药工业提供新技术,三、基因工程药物发展简史,1976年世界第一家应用DNA重组技术研究新药的公司美国Genentech公司成立。
1982年欧洲首先批准DNA重组的动物疫苗抗球虫病疫苗1982,美国,英国批准生产和使用了第一个基因工程药物人胰岛素。
“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是:
新型药物、疫苗和基因治疗,重点是利用现代生物技术手段,开发化学合成法难以生产的药品。
“十五”期间,863计划选择了信息技术、生物和现代农业技术、新材料、先进制造与自动化技术、能源技术、资源环境技术等6个高技术领域。
基因工程药物的种类,1、免疫性蛋白:
各种抗原和单克隆抗体2、细胞因子:
干扰素,白介素,集落刺激因子,表皮生长因子及凝血因子。
3、激素:
胰岛素,心钠素,生长激素。
4、酶类:
尿激酶,链激酶,葡激酶。
基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段:
上游阶段:
主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。
目的基因获得后,最主要的就是目的基因的表达。
选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能,其次是表达的量和分离纯化的难易。
此阶段的工作主要在实验室内完成。
下游阶段:
从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。
此阶段是将实验室的成果产业化、商品化,主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立,新型生物反应器的研制,高效分离介质及装置的开发,分离纯化的优化控制,高纯度产品的制备技术,生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造,电子计算机的优化控制等。
四、基因工程药物生产的基本过程,基因工程药物的上游技术:
1、基因克隆载体:
质粒载体,2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用3、核酸制备技术:
制备纯净、高质量的载体DNA和待克隆的核酸,才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。
1)用碱抽提法分离质粒DNA原理:
细胞pH12.0-12.6线状DNA变性,cccDNA不变性,加酸恢复pH到中性,变性的染色体DNA交织成网而沉淀,上清用酚处理使蛋白变性,用醇沉淀质粒DNA。
A)质粒DNA的小量制备B)质粒DNA的大量制备,2)染色体DNA的制备3)真核细胞RNA的制备DNA的凝胶(Agarose)电泳和凝胶中DNA的回收5)SDS-PAGE电泳和凝胶中DNA的回收,第二节目的基因的获得,目的基因的获取途径:
一、化学合成法二、逆转录法三、RT-PCR法:
问题:
来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因,为什么不能进行直接分离?
一、化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。
化学合成法有个先决条件是:
必须知道目的基因的核苷酸排列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
方法:
合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段,再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段,然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段,再用连接酶连接成完整的基因。
人工化学合成基因的限制:
a.不能合成太长的基因。
只适用于克隆小分子肽的基因。
b.人工合成基因时,遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难,如用氨基酸顺序推测核苷酸序列,得到的结果可能与天然基因不完全一致,易造成中性突变。
c.费用太高。
优点:
可进行密码子的改造,一、逆转录法,逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA克隆表达。
1、mRNApurification2、合成第一链cDNA3、cDNA第二链的合成4、cDNAcloning:
5、将重组体导入hostcell6、cDNAlibraryidentification7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,1、mRNApurification,1、首先必须考虑目的基因mRNA在特定生物组织中的丰度,一般要选择高丰度mRNA,细胞内RNA的组成和含量:
DNA:
95%核内,5细胞器RNA:
75细胞质,10%核内,15%细胞器rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%2、但实际操作时多用低丰度mRNA,为提高文库中目的克隆数目,要采用杂交或体外翻译系统确定RNA在组织细胞中的含量,以期得到较丰富的起始mRNA,采用琼脂糖凝胶电泳,非变性蔗糖梯度离心等方法分级收集不同长度mRNA,富集目的序列。
3、抑制RNA酶活性,纤维素柱纯化Poly(A)mRNA流程图,真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法。
3-polyA(20-250AAA)-oligo(dT),2、合成第一链cDNA,一次好的逆转录反应可使oligo(dT)选出的mRNA有530%被拷贝。
1、oligo(dT)引导的cDNA合成法。
缺点是必须从3端起始,逆转录酶无法到达mRNA的5端,对较长的mRNA难以操作。
2、随机引物引导的cDNA合成法。
根据多种可能的序列合成出6-10bp的混合物,从多位点同时进行,较易获得特长mRNA5端的序列,5,3,反转录酶(AMV),5,5,3,DNApol,5,3,加接头并连接到载体,筛选重组体并在体外进行表达,*随机引物合成cDNA,S1核酸酶,mRNA,此法是根据可能的序列合成出610个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物)作为合成第一链cDNA的引物。
在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3末端的oligo(dT)引物一处开始。
研究工作证实,对于特长的mRNA分子中的靠近5端序列,应用这种方法是比较容易得到克隆的。
3、cDNA第二链的合成,1.自我引导合成法:
碱水解mRNA,发卡引导第二链的合成,S1核酸酶必须是高纯度的,否则由于单链切割作用导致5端信息丢失,极少采用。
2、RNaseH降解取代法:
3、外加引物合成法,3、合成第二链cDNA,5帽状结构,PolyA尾巴,3,polyT,反转录酶(AMV),5帽状结构,PolyA尾巴,3,polyT,5,5,3,polyA,DNApol,polyA,5,3,连接到载体,筛选重组体并在体外进行表达,*置换法合成cDNA,PolyAT,PolyT,mRNA,磷酸钠,RNaseH,5,5,5,5,5,RNaseH降解取代法,全长cDNA链的合成,5帽状结构,PolyA尾巴,3,polyT-限制性内切酶,反转录酶(AMV),5帽状结构,PolyA尾巴,3,polyT-限制性内切酶,5,5,3,碱水解法碱解RNA,然后末端转移法在3加上polyG,polyT-限制性内切酶,3GGGGG,5-限制性内切酶-CCCC,DNApol,polyT-限制性内切酶,3GGGGG,5-限制性内切酶-CCCC,5,3,酶切并克隆到表达载体,筛选重组体并在体外进行表达,*引导法合成cDNA,mRNA,外加引物合成法,4、cDNAcloning:
质粒载体:
pUC(表达),pBR322噬菌体DNA:
gt11表达gt10噬菌体大于10Kb,质粒小于10Kb,大肠杆菌质粒载体,1质粒pBR322质粒质粒pBR322是经人工构建的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体,亦是应用最为广泛的克隆载体,利用pBR322曾克隆到多种基因,虽然现在已有多种具有更优良特性的新型克隆载体逐渐代替了pBR322在基因克隆中地位,但pBR322仍是人工构建的具有几乎所有的理想特性的基因克隆载体之一。
pBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。
“p”表示它是一种质粒;而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者FBo1ivar和RLRodriguez姓氏的头一个字母,“322系指实验室编号,以与其他质粒载体如pBR325,pBR327,pBR328等相区别。
第一部分:
来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因(ampr);第二部分:
来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr);第三部分:
来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点(ori),
(2)pBR322质粒载体的优点,1、第一个优点是具有较小的分子量,2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号,3、具较高的拷贝数,2pUC质粒载体,pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上,组入了一个在其5,端带有一段多克隆位点的lacZ基因,而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。
(1)来自pBR322质粒的复制起点(ori);
(2)氨苄青霉素抗性基因(ampr),但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化,不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点;(3)大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ基因;(4)位于lacZ基因中的靠近5”端的一段多克隆位点(MCS,multiplecloningsites)区,但它并不破坏该基因的功能(图)。
(2)pUC质粒载体的优点,与pBR322质粒载体相比,pUC质粒载体系列具有许多方面的优越性,是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。
其优点概括起来有如下三个方面:
第一、具有更小的分子量和更高的拷贝数第二,适用于组织化学方法检测重组体第三,具有多克隆位点MCS区,TheORFoftheinsertedgenehastobeinthesamedirectionasthatofthelacZAfusionproteincontainstheN-terminalsequenceoflacZandtheinsertedORFwillbeproduced,噬菌体载体,插入型载体:
只具有一个限制酶位点可便于外源DNA插入的载体.gt10、gt11用于克隆10kb的外源DNA,cDNA及小片段DNA取代型载体:
含有二个限制酶切点,在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代的载体。
EMBL克隆真核生物染色体DNA随着体外包装技术和寡聚核苷酸合成技术的发展,人们已经构建了许多带有多克隆位点的噬菌体载体,现在常规使用的噬菌体载体,不少既可用作插入型又可用作置换型。
总之,多克隆位点的引入不仅极大地扩展了噬菌体的克隆范围,同时还大大地简化了其操作技术。
5、将重组体导入hostcell6、cDNAlibraryidentification7、目的cDNA克隆的分离和鉴定(限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、转录起始点等。
),cDNA文库的筛选,同源探针:
-表达基因差异显示技术设计的探针:
DDRT-PCR反向引物为5-oligo(dT)MN-3引物(M,dA/dG/dC;N,dA/dG/dT/dC正向引物为随即核甘酸序列-利用已知基因的同源序列设计的探针:
特异性抗体筛选噬菌体表面展示技术酵母双杂交技术酵母单杂交系统,cDNA文库的建立过程,RNA提取,分离mRNA,OligodT或随机引物合成cDNA第一链,合成cDNA第二链,补平cDNA链末端,连接接头,连接噬菌体载体,包装噬菌体,感染、裂解宿主细胞,参数测定,分装、保存,转化或感染宿主菌培养分离,形成菌斑或噬斑。
(文库所形成的噬斑实际上要密得多),利用文库克隆目的基因,文库铺皿培养形成噬斑,转膜,核酸杂交或抗体反应,获得阳性克隆,核酸杂交适用于已知部分序列的目的基因克隆。
抗体反应适用于未知序列的但已经获得相应抗体的目的基因克隆。
放射性探针进行得第一轮筛库,在对应的培养皿上挑出相应的噬斑,扩大培养,由于挑出的噬斑不能保证是单个噬斑,所以必须进行第二轮筛库第二次的铺皿密度要小得多,以保证能够获得单斑,在对应的培养皿上挑出相应的噬斑,RT-PCR法:
mRNA经反转录合成cDNA第一链,然后在特异性引物协助下,用PCR进行扩增,特异的合成目的cDNA链。
对已发现基因的改造,通过对基因的功能相关区域研究,并采用基因修饰技术和点突变技术进行基因新功能研究和再确证,从而提高目的基因表达产物的稳定性和体内半衰期,提高表达产物的生物学活性,降低有效使用剂量或提高表达量,降低毒性或免疫原性,改造基因的方法:
应用突变技术更换活性蛋白的某些关键氨基酸残基通过增加、删除或调整蛋白质分子上的某些肽段或结构域或寡糖链将功能互补的两种基因工程药物在基因水平上融合,课堂小结,掌握基因工程在生物技术制药中的作用;目的基因获得方法及其优缺点;熟悉基因工程制药的基本过程。
作业,1、试论述传统制药存在的问题和基因工程技术生产药物的优点2、基因工程制药的基本过程包括哪些步骤?
3、目的基因获得方法有哪些?
并论述其优缺点4、来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因,为什么不能进行直接分离?
5、应用逆转录法获得目的基因时,mRNA的纯化时应注意哪些问题6、pBR322质粒和pUC质粒载体各具有什么特点?
7、改造目的基因的方法有哪些?
谢谢你的阅读,知识就是财富丰富你的人生,
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