兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性.docx

兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性.docx

《兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性.docx（6页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性

兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性

【摘要】目的：

在体外分离纯化VX2肿瘤细胞，观察其生物学特性.方法：

采用组织块法和消化法结合对兔VX2肿瘤进行原代培养,体外传代观察,传代40次并对培养细胞进行形态学观察、细胞周期检查、核型分析、兔及裸鼠移植.结果：

纯化的兔VX2肿瘤细胞形态一致，呈圆形、多角形的上皮细胞,体积小,核浆比倒置,体外连续培养8mo,传代50次以上,细胞倍增时间为h,细胞周期测定G1期为%,G2期为%,S期为%.染色体为亚三倍体核型,众数为60条.高细胞浓度可保证同种移植成瘤率,裸鼠移植可成瘤,无支原体污染.结论：

兔VX2肿瘤细胞系来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的鳞状上皮细胞恶性肿瘤,目前已经纯化，可应用于进一步肿瘤实验研究.

　　【关键词】兔;肿瘤细胞,培养的;肿瘤标记,生物学

　　0引言

　　兔VX2肿瘤是来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的上皮细胞恶性肿瘤，属于鳞状细胞癌，1940年建株［1］，国内文献对其来源描述不统一.其特点可接种在兔体内，具有较高的肺、肝转移特性，在大型动物模型的研究上具有很高的应用价值.国际上一直没有建成受到公认并广泛使用的VX2细胞系，多数仍以组织块方法保存.为进一步进行离体研究，我们分离并纯化了VX2瘤株，并进行了生物学特性观察.

　　1材料和方法1材料新西兰大白兔9只和BALB/c裸鼠均购自第四军医大学实验动物中心；原代培养所用肿瘤组织来源于本院液氮保存冰冻组织块，于新西兰大白兔腿部肌肉内接种并增殖.胎牛血清；培养瓶；RPMI1640；24孔板（Nunc,Roskilde,Denmark）；广谱抗细胞角蛋白（PCK）混合型鼠抗兔mAb，广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪mAb；秋水仙素离心机；其他试剂及仪器取自唐都医院中心实验室.2方法肿瘤细胞的分离纯化无菌摘取VX2肿瘤边缘增殖活跃部分,用PBS液冲洗3次,在显微镜下剔除多余组织，剪成直径～mm左右的小块,以g/L胰酶加1g/L胶原酶于37℃消化20min，200目尼龙网过滤后800r/min离心5min，取沉淀物培养，较低密度接种于6孔板.组织块贴壁接种于预先涂抹薄层FBS的培养瓶瓶底，瓶底朝上，向瓶内加入含100mL/LFBS和青链霉素双抗的RPMI1640培养液5mL，置37℃，50mL/LCO2，饱和湿度的培养箱内,2h后缓慢将培养瓶翻转.消化法第2日即见细胞生长.组织块法于第3日组织块均浮起，可见细胞生长.于岛状生长的细胞处在倒置显微镜下无菌刮取，培养，取得多瓶纯化细胞，其形态、生长速度基本一致.待细胞成片生长、占据大部分瓶底时即用g/L胰蛋白酶于37℃下消化传代.形态学观察分别取纯化后第10代和50代的细胞进行细胞爬片、HE染色、倒置显微镜镜下观察.将VX2瘤接种于兔腿部肌肉，待成瘤后切片光镜下观察.生长特性测定将第50代细胞以1×107/L的密度接种于24孔板，每孔加入含100mL/LFBS的1640培养基mL，置细胞培养箱中培养.每日同一时间用胰蛋白酶消化3孔细胞，血球计数板进行计数，连续进行4d，绘制细胞生长曲线.利用SPSS软件指数函数拟合模型（Exponential）辅助计算细胞群体倍增时间［2］.制作细胞爬片，分别于贴壁后24，48，72h计算分裂指数.琼脂集落形成率测定收集第52代细胞和相应的对照细胞，制备含细胞的g/L琼脂糖液，并加到7g/L琼脂糖凝胶上，于37℃，50mL/LCO2、饱和湿度条件下培养.3wk后计算集落形成率.免疫细胞化学分析取第55代细胞爬片，室温下用1∶1混合的甲醇与丙酮将生长在盖玻片上的细胞固定15～20min，分别应用PCK混合型鼠抗兔mAb及超敏加广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪mAb行免疫组织化学染色，光学显微镜下观察.染色体分析取处于80%汇合时的第60代细胞加入终浓度为mg/L的秋水仙素，在37℃，50mL/LCO2、饱和湿度的培养箱中孵育5h,然后尽量吹打使阻断于分裂中期的细胞脱壁，将细胞悬液装入10mL离心管.1100r/min离心10min，去上清液，再向离心管中轻轻加入6mL低渗盐溶液75mmol/LKCl，37℃静置30min.然后加入2mL新鲜固定液预固定，用移液管吹打调匀.1100r/min离心10min，去上清液.之后加入新鲜固定液8mL，轻轻吹打均匀，离心10min；本步骤再重复2遍.末次离心后，小心吸除大部分上清液，余下～mL固定液，轻轻吹打调匀.吸少量细胞悬液，滴落在-20℃预冷过的洁净载玻片上,迅速在酒精灯火焰上烤干.制备好的玻片立即用Giemsa染色.显微镜下观察染色后的标本，统计其染色体数目.细胞周期测定用g/L胰蛋白酶加g/LEDTA消化培养细胞，确保细胞尽可能打散，PRM1640重悬后移至mL离心管中，PBS离心清洗3遍后，加入DPBS配制的750mL/L冰乙醇，4℃固定2h或过夜，PBS再离心清洗1遍后用1g/LRNase37℃消化20～30min，DPBS离心清洗2遍，300目尼龙网过滤，～mLDPBS重悬，PI染色5min后流式细胞仪测定细胞周期.同种异体移植取第60～70代的对数生长期细胞，将新西兰兔分为3组，每组3只，分别以1×109，1×1010，1×1011个/L的细胞悬液4mL接种于兔腿部肌肉，观察肿瘤在肌肉内的生长情况.裸鼠移植取第60～70代对数生长期细胞2×1011个/L,接种于3只BALB/c裸鼠腋窝皮下,每只1mL，观察肿瘤在肌肉内的生长情况.支原体及致高钙血症能力检测采用地依红染色及肉汤培养法检测培养液及细胞内支原体.对成功接种VX2瘤的兔子进行耳缘静脉采血，检测血清钙离子浓度［3-4］.细胞系的维持、冻存与复苏取对数生长期细胞，用DH

　　anks液漂洗3遍，g/L胰蛋白酶加g/LEDTA消化细胞5min，收集细胞，800r/min离心5min，用1640培养液重悬细胞，每瓶细胞分种3～5瓶，同时冻存适量细胞，冻存液为培养液中加入100mL/L血清及80g/L二甲基亚砜，放入液氮罐中保存.将盛有VX2细胞的冷冻管从液氮中取出，37℃水浴，使细胞迅速融化，将细胞悬液移入预温至37℃、含有100mL/L血清的1640培养液中，置于37℃，50mL/LCO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞的成活率大于80%.

　　2结果

　　细胞形态最初纯化的细胞部分在相差显微镜下可见扇形细胞质,经过一段时间传代，细胞呈上皮样细胞排列,单层贴壁生长,有铺路石征，生长成团后即出现重叠生长现象，细胞以多边形为主.HE染色见细胞轻度嗜碱,核大,核质比例异常,细胞呈异型性明显，可见较多核分裂象（图3）.

　　生长特性细胞生长于第3日达到高峰.细胞倍增时间为h.第55代细胞的生长曲线见图4，细胞分裂指数分别为：

24h，%；48h，%；72h，%.双层琼脂形成率为%.

　　图1倒置显微镜下兔VX2肿瘤细胞呈扇形细胞质×400

　　图2传代后倒置显微镜下兔VX2肿瘤细胞呈多边形为主×100

　　图3兔VX2肿瘤细胞形态×100

　　免疫组织化学染色细胞胞质中可见到PCK免疫组织化学染色弱阳性，波纹蛋白染色阴性.

　　染色体分析在100个分裂中期细胞中，染色体数目主要分布于57～62之间，染色体众数为60，多为亚三倍体.染色体有缺失、断裂、易位等结构异常.

　　细胞周期分析流式细胞仪分析结果显示G0/G1：

%；G2/M：

%；S：

%；G2/G1：

；DI：

　　图4第55代细胞的生长曲线

　　同种异体移植及裸鼠移植以1×109个/L细胞密度接种的3只兔子均未成瘤；以1×1010个/L接种的有2只成瘤，其中1只于3wk后停止生长，解剖后可见瘤体基本为豆渣样坏死；以1×1011个/接种的有2只成瘤.3只成功成瘤的兔子成瘤潜伏期约10d，分别于36，38，45d后衰竭死亡.解剖后可见瘤体无包膜，呈侵润性生长，中心豆渣样坏死，多有大量脓血，广泛转移，与传统组织块接种法成瘤特点一致.3只裸鼠均成瘤.

　　图5兔VX2细胞裸鼠移植，可见后肢皮下有成瘤现象

　　支原体及致高钙血症能力检测支原体检测阴性.动物在接种后1wk化验血钙波动在～mmol/L之间.

　　3讨论

　　兔VX2肿瘤是世界上广泛使用、可在大型动物体内生长的恶性肿瘤，常用于恶性肿瘤介入和射频治疗的研究［3-5］及影像学研究和动物模型的建立［6-7］，其优越性是小型实验动物肿瘤模型所无法比拟的.国内经常采用部位命名法来命名VX2肿瘤，如兔VX2肝癌，却忽视了VX2瘤是乳头瘤恶变而成的上皮来源的恶性肿瘤.国外对于体外VX2细胞系的建立一直有争议，Osato等最早与1967年体外培养的VX2细胞由于培养箱故障而丢失［8］，Voelkel等［9］建立了一株VX2细胞系，活力成瘤能力低，并且丧失了产生PGE2的能力，没有受到公认.1982年Easty等［10］建立了VX2细胞系，与此同时瑞士的Rolf等也建立了该细胞株，并与之有差异，而比较结果没有报道，细胞系也没有广泛应用.1985年Georges等［11］发现了2种不同的VX2瘤株，一种VX2R高表达角蛋白，仅能在裸鼠体内成瘤，另一种VX2R低表达角蛋白，成瘤能力强.Dabbous等［12］1980年也曾发现3种形态不同的VX2细胞.刘险峰等［13］纯化了一株高表达角蛋白，高成瘤能力的VX2瘤株.本实验纯化的VX2瘤株形态学上与文献［8,10,11］的报道结果相似，致高钙血症能力检测，与Doppelt等［14-15］的结果相同，从角蛋白表达低、接种后兔存活期短来看，恶性程度比较高，但是成瘤能力较国内一些研究较弱.我们还发现接种后有个别肿瘤自发性衰退的现象，与Osato等报道的VX7瘤自发性衰退相似.结合本实验和国外的文献报道，考虑VX2自身可能发生一定程度的分化，这可能与VX2瘤在国内外多以冰冻组织块法保存有关，发生自发性衰退和恶性程度减低的细胞必然在传代的过程中淘汰，因此怀疑VX2的恶性程度略有增高的可能性大，但是VX2肿瘤的基本性质没有变化，仍然是一株具有很高实用价值的应用与大型实验动物的肿瘤细胞.1988年VX2瘤株从日本传入我校以来，一直主要以液氮冷冻组织块和动物体内传代结合的方法保存，为进行进一步体外研究，我们纯化了该细胞系，经过长时间传代，性质稳定，可用于体外实验.实验中发现的低细胞数量下成瘤能力下降和自发性消退现象，其原因尚需进一步研究.

　　【参考文献】

　　［1］KiddJG,RousP.Cancerderivingfromviruspapillomasofwildrabbitsundernaturalconditions［J］.JExpMed，1940，71（4）:

469-494.

　　［2］严泉剑,李六金,张宇梅，等.生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算［J］.第四军医大学学报，2002，23（10）:

293.

　　［3］RheeTK,LarsonAC,PrasadPV,etal.FeasibilityofbloodoxygenationleveldependentMRimagingtomonitorhepatictranscatheterarterialembolizationinrabbits［J］.JVascIntervRadiol,2005,16（11）:

1523-1528.

　　［4］EivaziB,SapundhzievN,FolzBJ,etal.BipolarradiofrequencyinducedthermotherapeuticvolumetricreductionofVX2metastasesinananimalmodel［J］.InVivo,2005,19（6）:

1023-1028.

　　［5］HaagaJR,ExnerAA,WangY,etal.Combinedtumortherapybyusingradiofrequencyablationand5FUladenpolymerimplants:

Evaluationinratsandrabbits［J］.Radiology,2005,237（3）:

911-918.

　　［6］SapundzhievN,DunneAA,RamaswamyA,etal.TheauricularVX2carcinoma:

Feasibilityofcompletetumorresection［J］.AnticancerRes,2005,25（6B）:

4209-4214.

　　［7］MaruyamaH,MatsutaniS,SaishoH,etal.Sonographicshiftofhypervascularlivertumoronbloodpoolharmonicimageswithdefinity:

TimerelatedchangesofcontrastenhancedappearanceinrabbitVX2tumorunderextralowacousticpower［J］.EurJRadiol,2005,56

（1）:

60-65.

　　［8］OsatoTT,ItoY.InvitrocultivationandimmunofluorescentstudiesoftransplantablecarcinomasVx2andVx7［J］.JExpMed,1967,126（5）:

881-886.

　　［9］VoelkelEF,TashjianAHJr,FranklinR,etal.Hypercalcemiaandtumorprostaglandins:

TheVX2carcinomamodelintherabbit［J］.Metabolism,1975,24（8）:

973-986.

　　［10］EastyDM,EastyGC.EstablishmentofaninvitrocelllinefromtherabbitVX2carcinoma［J］.VirchowsArchBCellPatholInclMolPathol,1982,39（3）:

333-337.

　　［11］GeorgesE,BreitburdF,JibardN,etal.TwoShopepapillomavirusassociatedVX2carcinomacelllineswithdifferentlevelsofkeratinocytedifferentiationandtransplantability［J］.JVirol,1985,55

（1）:

246-250.

　　［12］DabbousMKh,HaneyL,ElTorkyM,et　collagenolyticsystemofinvasivetumours［D］.ProcAmAssocCancerResAmSocClinOncol,1980,21:

33.

　　［13］刘险峰，任乐荣，苏广彦,等.兔VX2肿瘤细胞系的建立及其生物学特性的观察［J］.中华病理学杂志,2005,34（10）:

66

　　1-663.

　　［14］YonedaT,KitamuraM,OgawaT,etal.ControlofVX2carcinomacellgrowthinculturebycalcium,calmodulin,andprostaglandins［J］.CancerRes,1985,45

（1）:

398-405.

　　［15］DoppeltSH,SlovikDM,NeerRM,etal.GutmediatedhypercalcemiainrabbitsbearingVX2carcinoma:

Newmechanismfortumorinducedhypercalcemia［J］.ProcNatlAcadSciUSA,1982,79

（2）:

640-644.