REACH法规 第四卷译稿16.docx

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REACH法规第四卷译稿16

B．13/14.诱变（性）：

利用细菌进行的回复突变测定

1.测定方法

这一测量方法是OECDTG471（经济合作与发展组织热重量分析法）的重复，细菌的反向突变测定（1997）。

1.1.引言

细菌的反向突变测定利用需求氨基酸的沙门氏typhimurium菌属和埃希氏大肠杆菌来检测点突变,其包括少数DNA碱基的置换、增加或缺失

（1）

（2）（3）。

细菌反向突变测定的原则是它检测突变，这些回复突变出现在测试菌株中并且修复细菌合成一种基本氨基酸的能力。

回复突变菌株通过它在缺乏氨基酸的培养基中的生长而得到检测，而它的父系对这种氨基酸是必需的。

点突变是许多人类遗传性疾病的成因并且有关于在致癌基因和肉细胞的肿瘤抑制基因中的点突变与人类和动物样品样品的肿瘤形成有关实质性的证据。

细菌反向突变测定是快速,廉宜和相对地容易的方法。

大部分测试菌株有使许多特征，折兑它们检测突变变的更敏感，这些突变包括在回复位点DNA序列的响应，增加细胞对大分子的透性，消除DNA修复系统的正常功能而增加错误倾向的DNA修复过程。

测试菌株的特征能对遗传毒性的试剂引起的突变类型能提供一些有用的信息。

。

为大范围结构种类而设的一个非常大的结果实验数据库可用于细菌反向突变测定并且已确立的方法学已经为测定不同的物理化学药品包括挥发性的化合物而被发展。

见描述引言部份B.

1.2.定义

回复突变测试是利用在沙门氏typhimurium或埃希氏大肠杆菌中测试氨基酸（分别是组氨酸和色氨酸）需求的菌株通过突变变成不在需求外源的氨基酸

碱基对替换突变是能导致DNA碱基改变的突变。

。

在一个恢复测定中这一变化可能在最初的突变位置发生,或者在细菌基因组的第二位置。

移码突变是能够引起DNA中一对或者更多的基对增加或缺失，从而改变了RNA的读码结构的突变。

1.3.初始条件

细菌反向突变测定利用原核细胞，其在很多方面不同于哺乳动物细胞如摄取，新陈代谢，染色体结构和DNA修复过程中。

在体外引导下的测定一般需要利用新陈代谢活化作用的外胚胎资源.在体外（微晶）下的新陈代谢活性系统不能够完全地模拟哺乳动物体内的系统。

因此测定不能提供关于测试物质对哺乳动物突变和潜在致癌的直接信息。

细菌反向突变测定被广泛应用于遗传毒性活性、特别是点突变诱导的活性的广泛测试。

足够多的实验数据显示很多化学物质在测试中显示阳性，在其它测试中也显示诱变活性。

有一些具有诱变活性的化学物质在本测试中没有被检测出来，这些缺陷可以归咎于终点测试的特性，新陈代谢活化作用的不同，或不同的生物药效。

另一方面，提高细菌反向突变测定的敏感因素能导致诱导有机体突变物质活动的过度评估。

细菌反向突变测定不适用在化学药品某一级的评估，例如高度杀菌化合物（例如，某抗生素）和那些被认为（或已知的）明确地妨碍哺乳动物样品的细胞复制系统（例如，一些局部异构酶抑制剂和一些核苷类似物）。

在此情况下，哺乳动物样品的突变测定可能是更合理。

虽然在此测定中很阳性的许多化合物是哺乳动物样品的致癌物质,相互关系不是绝对的。

它依赖于化学药品级并且有不被此测定发现致癌物质因为它们行动超过其他的非基因毒性的机制或在细菌的细胞中绝少的机制。

1.4.测定方法原则

细菌细胞的悬浮液接触于测试物质存在或缺少外生新陈代谢活化系统中。

在平板测试方法中，这些悬浮液同琼脂混合和立即被涂布在最小的培养基之上。

在预孵化方法中，处理好的混合物被孵化然后和琼脂混合再涂布到最小的培养基上。

对此两项技术而言，经二到三天的孵化后，回复体群体被计算并与溶剂对照涂层上的自然产生的回复体群体的数目相比较。

实施细菌反向突变测定的一些实验步骤已经被描述。

在其中被普遍采用是涂层结合法

（1）

（2）（3）（4），预孵化法

（2）（3）（5）（6）（7）（8），流动法（9）（10）和悬浮液法（11）。

气体或水汽测定的修正已经被描述为（12）。

在方法中被描述的实验步骤主要属于涂层结合法和预孵化法。

二者之一对有或没有新陈代谢活化作用的引导实验均是可接受的。

一些物质可能被发现在预孵化法中使用更有效。

这些物质属于包括短链脂肪族亚硝胺，二价金属，乙醛，偶氮染料和二氮化化合物，pyrollizidine生物碱，烯丙基化合物和硝基化合物（3）的化学级药品。

一般能辨认出诱导有机体突变的物质某一级不总是在用涂层结合法或预孵化法的标准实验步骤中被发现。

这应该被视为“特殊事例"和一般强烈地推荐可选择的实验步骤应该用于它们的研究。

下列各项"特殊事例"可以被识别（连同可以用于探测的实验步骤的例子一起）:

含氮染料和二氮化合物的混合物（3）（5）（6）（13）,瓦斯和挥发性化学物质（12）（14）（15）（16）和葡萄糖甙（17）（18）.A来自标准的实验步骤偏离需要科学的校正.

1.5.测定方法的描述

1.5.1.准备

1.5.1.1.细菌

细菌的最初的培养直到指数晚期或平台生长时早期（大约每毫升109个细胞）.平台期晚期的培养物不应该被使用。

在实验中被用的培养包含一个高浓度活的细菌是必要的.浓度测定可以从生长曲线上的以往的实验数据或在每个测定中经过一个涂层培养活细胞数目的测定实验.

被推荐的培育温度是37°C.

至少五种细菌的菌种应该被用.这些应该包括四个菌种S.typhimurium（TA1535;TA1537或TA97a或TA97;TA98;和TA100）是在不同实验室之间显示可靠和可再生性的反应.这四种S.typhimurium菌种有GC碱基对在主要的回复位置。

一般情况下可能不测定特定的氧化剂诱导有机体突变的物质。

交联的试剂和水合物。

这些试剂可能被在主要回复位置有AT碱基对的大肠杆菌WP2菌种或S.typhimuriumTA102（19）测定到因此被推荐的菌种的组合是:

–S.typhimuriumTA1535,和

–S.typhimuriumTA1537或TA97或TA97a,和

–S.typhimuriumTA98,和

–S.typhimuriumTA100,和

–E.大肠杆菌WP2uvrA,或E.大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）,或S.typhimuriumTA102.

为了要测定到交联的的诱导有机体突变的物质它最好包括TA102或E.coli的DAN修补菌种.[例如.E.大肠杆菌WP2或E.大肠杆菌WP2（pKM101）]

应使用已成型的原料繁殖培养、标记物确认和储藏步骤。

氨基酸生长需要在冰冻的繁殖培养皿中进行。

（组氨酸对S.typhimurium菌种和,色氨酸对E.大肠杆菌菌种）.其他的显型应该同样地被检查,即:

是否在合适位置出现R-因子等离子体[如菌种TA中的氨比西林对抗在菌种TA98,TA100和TA97a或TA97，WP2uvrA和WP2uvrA（pKM101）,和氨比西林+四分染色体在对抗菌种TA102];特征突变的存在（如rfa在S.typhimurium中的突变在S中的变化.通过紫色水晶的感光度和uvrA在E.大肠杆菌中的突变uvrB在S.typhimurium中的突变,通过紫外光检验）

（2）（3）.菌种应该产生计算在实验室的历史控制数据中的频率范围内的自然的回复突变等位基因群体板块并在参考文献报道过的范围内.

1.5.1.2.介质

使用一个合适的小琼脂（例如包含最小的Vogel-Bonner媒介物E和葡萄糖）,和一个覆盖琼脂，包括组氨酸和维生素H或色氨酸用于少数细胞分离，在

（1）

（2）（9）中使用过。

1.5.1.3.新陈代谢活化

无论是否在一个合适的新陈代谢系统中，细菌都应该接触测定物质。

最普遍的系统是补体因子补充的从啮齿动物样品的肝脏中提取的酶激发试剂（例如Aroclor1254

（1）

（2）或本巴比妥和萘黄酮（18）（20）（21）处理的线粒体片断。

线粒体片断经常使用的浓度范围在S9-混合物，体积比从5%到30%，新陈代谢活化系统的选择和条件可能依赖于被测化学物质的等级，在有些情况下，它可能对多于一种浓度的线粒体片断适用。

对azo-染料和二氮化合物的-混合物使用一个还原新陈代谢活化系统可能更适当（6）（13）.

1.5.1.4.测定物质/准备

固体测定物质应该溶解或悬浮在合适的溶剂或媒介物中并且如果合适的话就在处理前稀释，液体测定物质应该直接加到测定系统中并且/或在处理前稀释。

新鲜准备的应该使用，除非稳定数值证明储藏的可接受性。

溶剂/媒介物不应该与测定物质化学反应，并且应该和细菌和S9活动生存共处。

如果不是用的众所周知的溶剂/媒质，它们的内含物应该被它们的共有的预测实验数据所支持。

可能的话建议首选水溶剂/媒质。

当测定对水不稳定的物质时候,使用的有机溶剂应该无水.

1.5.2.测定情况

1.5.2.1.测定菌种（见1.5.1.1）

1.5.2.2.暴露浓度

决定最高的使用的测定物质含量时，需要考虑到的标准条件之一是在最后处理混合物时细胞的毒性和溶解度.

在初步的实验中决定的毒性和溶解度可能是有用的。

细胞毒性可能通过回复菌群数目的衰减被测定到。

对菌苔生长背景的清除或缩小或所处理的培养物的存活程度。

一种物质细胞毒性可能随着新陈代谢系统的变化而变化。

在实际测定条件下，很明显不溶物应该在最后的混合物中作为沉淀。

我们推荐测定可溶的无细胞毒性的物质的最大浓度为五毫克每板或五微升每板。

对于溶解度小于五毫克每板或五微升每板的无细胞毒性物质在最后处理混合物时应有一到多个被测浓缩物不溶。

有细胞毒性的待测物质的溶解度若已低于五毫克每板或五微升每板则应测到某一细胞毒性浓度。

记录时不应受沉淀物的影响。

在最初的实验中，至少要有五种不同的可分析的待测物质的浓缩物，在测定点之间用半对数。

当研究调查一个浓度-反应曲线时使用较小的间隔较为合适。

在上述测定中，当评估确实含有能引导基因突变的杂质时，应考虑五毫克每盘或五微升每盘的浓缩物。

1.5.2.3.阴性和阳性的对照组

协同的特定菌种阳性的和阴性的对照组无论参不参与新陈代谢，都应在每次测定中有所涉及。

在测定中应选择有阳性反应的阳极对照组的浓缩物。

对于涉及到新陈代谢系统的测定，应在所用细菌的菌种的类型的基础上选择阴极对照组的参考物质。

下列各项物质为在涉及新陈代谢的测定中恰当的阳极对照组的例子。

CAS编号

EINECS编号

名称

781-43-1

212-308-4

9,10-二甲基蒽

57-97-6

200-359-5

7，12-二甲基苯[α]蒽

50-32-8

200-028-5

苯并[α]芘

613-13-8

210-330-9

2-胺蒽

50-18-0

200-015-4

环瞵酰胺

6055-19-2

水合环瞵酰胺

下面的实验数据是对于减少新陈代谢活动的方法的一个恰当的阳极对照组的例子：

573-58-0

209-358-4

刚果红

2-氨基蒽不能作为指示S9-mix效果的核心指示剂，如果使用它，应用诱导有机体基因突变的物质标记每一组S9-mix，该物质需要通过微粒体的酶诱发其新陈代谢作用。

例如苯并[a]嵌二萘，二甲基苯并蒽。

下列各项物质是特殊菌种特殊的无外生的新陈代谢活化系统中阳性对照组的例子.

26628-22-8

247-852-1

叠氮化钠

Ta1513andTA100

607-57-8

210-138-5

2-硝基芴

TA98

90-45-9

201-995-6

9-氨基氮蒽

TA1537,TA97andTA97a

80-15-9

201-254-7

Icumene过氧化氢物

TA102

50-07-7

200-008-6

丝裂霉素C

WP2uvrAandTA102

70-25-7

200-730-1

N-乙基—乃春-N-亚硝基胍

WP2，WP2uvrAandWP2uvrA（PKM101）

56-57-5

200-281-1

4-硝基萘-1-氧化物

WP2,WP2uvrAandWP2uvrA（PKM101

17070-45-0

241-129-4

ICR191

TA1537,TA97andTA97a

3688-53-7

呋喃基糠酰胺

含质粒菌株

可以使用其他的适当阳性参考物质，可能时应该考虑相关等级的阳性化学物质。

应该对仅由溶剂或媒介物单独组成的没有测定物质的阴性对照组也用同样的方法处理。

另外，未处理的对照组也应该使用，除非由以往的对照组实验数据证明选择的溶剂没有有害的或能引起突变的作用。

1.5.3.实验步骤

对于板结合方法

（1）

（2）（3）（4），没有新陈代谢活化作用,通常把0.05毫升或0.1毫升测定溶液,0.1新鲜的细菌的培养液（大约包含108能成活的细胞）和0.5毫升的无菌缓冲液和2.0毫升的琼脂混合.对测定新陈代谢活化作用，通常把0.5毫升的新陈代谢作用混合物包含足够的线粒体部分（新陈代谢混合物的体积比范围从5到30%v/v）和叠琼脂（2.0毫升）混合,并加入细菌和测定物质/测定溶液.每管的内容物是混合的并倾倒在最小的琼脂板的表面.琼脂在培育之前凝固。

对于预培养方法

（2）（3）（5）（6），测定物质/测定溶液应该和测定菌种（大约包含108个能成活的细胞）和无菌的缓冲液或0.5毫升的新陈代谢活化系统一起在35~37摄氏度在与琼脂混合之前和倒在最小琼脂表面之前预培养。

通常把0.05或0.1毫升测定物质/测定溶液,0.1毫升细菌和0.5毫升的S9-mix或无菌缓冲液和2.0毫升的琼脂混合.试管通常在预培养期间用一个振摇机通气。

对一个突变恰当的评估，每剂量应使用三层镀层。

当科学证明其合理时，允许使用复制的板。

一个板偶然的活力消退并不代表测定无效。

气体或挥发性的物质应该用特定的方法测定，例如在封闭的容器中（12）（14）（15）（16）.

1.5.4.培育

在给定的测定中所有的板应该在37°C培育48-72小时.在培育

时期后,计算每板回复突变的菌群的数目。

2.实验数据

2.1.结果的处理

实验数据中应该列出每板回复菌群的数目。

在阳性和阴性（溶剂对照组和未处理对照组）对照组板上回复菌群的数目都应该给出。

每个板的数目平均回复菌群数目/板和标准偏差应该在被测物质、阳性和阴性（未处理的和/或溶剂）对照组列出。

不要求证实一个确切的阳性反应。

不明确的结果应该是用一个修改过的更好的实验条件进一步测定以弄清楚。

阴性结果需要在事实依据的基础上确定，在这些事实中，不需要考虑阴性结果的证实，只需提供理由。

修改研究参数已扩大评估条件的范围，应该考虑以下的实验。

可能修改的研究参数包括浓度差、处理方法（板合并或液体预培养）和新陈代谢活化条件。

2.2.实验结果评价与分析

决定一个阳性结果有几个标准，例如与浓度有关的超过测定范围的增加和/或一个在一个或更多个浓度能再生产的增加。

这些浓度是在每板回复菌群的数量在至少一个有或没有新陈代谢活化系统的菌种。

应首先考虑结果的生物关系。

统计方法应该作为辅助评估测定结果的工具（24）。

然而,统计的意义不应该是唯一决定阳性反应因素。

一个测定物质，它的结果若不符合上述标准，应认为它在这个测定中时不引起突变的.

虽然大多数的实验将会清楚地给出阳性或阴性结果,在稀少的情况下实验数据放置将会排除作有关测定物质活性的一个明确的判断.结果可能保持不明确性或可疑性，不管重复多少次测定。

细菌的反向突变测定的阳性结果说明物质通过替代或移码方式来诱导点突变在沙门氏菌typhimurium及大肠杆菌.阴性结果显示那在测定之下情况,测定物质在被测定的种方面不是诱导有机体突变的物质.

3.实验结果报告

测定结果报告

测定结果报告必须包括下列信息:

溶剂/媒介物:

-选择溶剂/媒介物的理由

-测定物质在溶剂/媒介物中的溶解度和稳定性

-菌种

-使用的菌种;

-每份培养液中的细胞数目

-菌种特性.

测定条件：

:

-每板测定物的量（毫克/板或微升/板）和剂量选择的理论依据以及每个浓度的板数

-使用的介质

-新陈代谢活化系统的类型和组分包括可接受标准

-处理实验步骤

结果:

-毒性迹象

-沉降迹象

-每板容量

-每板回复菌群的平均数目及标准偏差

-（在可能的地方）剂量-回应关系

-统计学分析（如果有）

-同时进行的阳性（溶剂/媒质）和阳性对照组实验数据，并附上范围，平均值和标准偏差-以往的同时进行的阳性（溶剂/媒质）和阳性对照组实验数据，并附上范围，平均值和标准偏差

结果的讨论.

结论.

4.参考文献

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