基因工程复习要点.docx
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基因工程复习要点.docx
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一
1.载体的功能
1.运送外源基因高效转入受体细胞
2.为外源基因提供复制能力或整合能力
3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
2.基因工程学科建立的理论和技术发明
1.三大理论:
DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码
2.三大技术:
工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现
3.质粒的特点
质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子,也称cccDNA.通常在1~100范围内。
自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性
4.描述PBR322质粒筛选过程
PBR322质粒有两个标记基因,氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则
1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上,未长的菌落是未导入质粒的菌落
2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上,在四环素上不长但在氨苄青霉素上长的转化子即为重组子。
5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程
PUC是在PBR322质粒上改造的
若在lacZ’标记基因上插入外源DNA,则
将转化液涂布在含有Amp的平板上,蓝色菌落为非重组子,白色菌落为重组子,没长的未导入质粒。
6.基因工程操作的基本流程
1.离:
从供体细胞中分离出基因组DNA
2.切、连:
用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上,构成重组DNA分子
3.转、增:
将重组DNA导入受体细胞,段时间培养转化细胞,以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中
4.筛:
筛选经转化处理的细胞,获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞
5.表达:
筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达
7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要
1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充
2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因
3.在致癌病毒的研究中发现癌基因,为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索
8.蓝白斑筛选
是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝,可使整个菌落产生蓝色变化。
人工插入外源基因后突变型大肠杆菌的β-半乳糖苷酶被插入的外源基因切断,无法形成完整的β-半乳糖苷酶,故不能对无色化合物X-gal进行切割,菌落呈白色。
9.噬菌体载体与质粒相比的优点是什么
1.感染效率更高2.扩增速度快,复制量大3.插入容量大4.筛选更简单
10.描述碱变性法提取质粒的原理和过程
原理:
大肠杆菌裂解后有两种DNA为染色体DNA和质粒DNA,将细胞裂解后的溶液中加入强碱调pH至12.0,两种DNA均变性,再加入高盐溶液如KAc将pH调至中性,此时,染色体DNA生成白色絮状沉淀,而质粒DNA很快复性。
过程:
1.酶或机械法等破坏细胞,释放出胞内物质
2.加碱使DNA与蛋白质变性,加中和液复性
3.在上清液中通过酚-氯仿抽提,去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解,除去蛋白质
4.加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离
5.将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中,温浴降解RNA后电泳检测,-20℃保存。
11.三种提取质粒方法的特点和应用
1.碱变性法:
提取量可大可小,纯度相对较高,大部分实验可用
2.沸水浴法:
提取快速,纯度不高,提取量小,可用于快速筛选
3.离心法:
纯度非常高,提取时间长,操作复杂,主要用于基因治疗
12.基因工程学科的局限性
1.生态上,基因不受控制的扩散,如植物花粉传播使杂草获得抗虫抗除草基因
2.转基因食物随人体肠道菌群排泄到水体,从而进入生态链,造成基因污染
3.可能造成人种的基因歧视
二
1.酶切反应如何终止?
1)将反应液在65℃下加热5—10分钟;
2)向反应液中加入EDTA(螯合激活剂Mg2+)。
2.影响DNA连接反应的因素有哪些?
最重要的是哪一点?
1)DNA连接酶的酶量:
黏性末端一般为0.1U,平末端一般为1U;
2)连接时间:
5分钟至过夜;
3)反应温度:
4—16℃;
4)插入DNA与载体DNA的分子摩尔比,最佳比为3:
1(最重要的一点)
3.对于平末端,如何进行更好的连接?
1)末端同聚物加尾法:
利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3‘端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工黏性末端,外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶作用下连接成为重组的DNA。
2)衔接物连接法:
先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头,使之形成黏性末端之后,再用DNA连接酶将它们连接起来。
4.简述碱性磷酸酶的作用。
碱性磷酸酶可将5‘磷酸转化为5‘-OH,从而防止DNA自连,提高DNA连接效率。
5.介绍两种制备探针的方法。
1)切口平移法制备DNA探针的过程:
①使用DNA酶Ⅰ在DNA双链上随机切开若干切口,切口处分别形成3′和5′末端。
②利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′核酸外切活性,在切口处按5′→3′方向切除单核苷酸;同时利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′的聚合酶活性,在切口处3′端加入底物中的单核苷酸,使脱氧核苷酸链得以延伸。
③随着反应的进行,切口不断按5′→3′的方向移动,底物中被标记的单核苷酸被掺入到DNA链中,直至被标记的DNA片段两条链的3′端时完成标记。
2)末端标记法:
(三种:
3‘末端标记法、5‘末端标记法、T4聚合酶替代法,这里讲的是3‘末端标记法)
利用Klenow片段填补由限制酶消解DNA所产生的凹陷末端,通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶催化标记的dNTP加到3‘末端上。
6.什么是末端转移酶?
其作用是什么?
定义:
一种能够将脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)加到某DNA片段上3‘-OH上的不需要模板的DNA聚合酶。
作用:
可在DNA3‘末端添加特定的核苷酸,在人工黏性末端的构建中极有用处。
特点:
无需模板的DNA聚合酶、具有5’至3’端的DNA聚合活性
7.什么是限制与修饰作用,描述过程。
原核细胞为了保护自己,选择性的降解外源DNA,并保护个体免疫于外来DNA侵入系统。
主要由限制性内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
8.影响限制性核酸内切酶的影响因素。
酶的纯度、酶切反应的温度与时间、DNA样品的纯度、DNA分子的构型、DNA甲基化的程度、限制性核酸内切酶的反应缓冲液。
9.三种限制性核酸内切酶的特点。
Ⅰ型:
能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。
Ⅱ型:
能识别专一的核苷酸顺序,并在改顺序内的固定位置上切割双链,识别顺序是一个回文对称顺序。
Ⅲ型:
有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
10.Klenow酶的定义活性及作用
定义:
Klenow酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ端的大片段
活性:
5’~3’的聚合活性,3’~5’的外切教正功能。
用途:
修复由内切酶造成的3’凹断,使之成为平末端、催化cDNA第二条链的合成、用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。
11.逆转录酶有哪些酶活性
RNA指导的DNA聚合酶活性、RNaseH活性(水解DNA)、DNA指导的DNA聚合酶活性
12.S1核酸酶
是一种高度单链特异的核酸内切酶,酸性条件下,由Zn2+激活、降解单链DNA或RNA、降解反应方式为内切或外切,酶量过大时会伴有双核苷酸的降解
作用:
切平突出的单链末端
三
1.核酸提取的注意点(提取通则)
1)冰上操作,可降低酶活性,防止核酸被降解;
2)操作尽可能快速;
3)操作时要温柔,如不能用振荡器来振荡核酸,否则核酸容易断裂;
4)防止酶的降解,尤其是RNA,因为RNA酶多,且多数耐高温,耐酸碱不易失活。
2.为什么RNA提取比DNA更困难?
1)RNA比DNA易被降解:
RNase(核糖核酸酶)是非常稳定的酶,能够耐受高温高压,很难除去,DNase(脱氧核糖核酸酶)高温下易失活,因此RNA比DNA更容易因为污染了酶而被酶降解;
2)RNA在弱碱性条件下更容易分解,酸碱性耐受性差;
3)从结构来说,RNA更容易分解的机理是:
在2‘位置上有游离的-OH,以致形成2‘,3’-环形磷酸盐的中间产物,分解需要更低的自由能,因此易分解。
3.核酸提取之后,如何确定产量和浓度?
1)测核酸的OD260的值,若OD260=1,则代表有50μg/μL的DNA,40μg/μL的RNA;
2)测OD260/OD280的值,DNA在1.6—1.8,RNA在1.8—2.0,若比值小,则表明蛋白质超标。
4.凝胶电泳分离核酸的原理。
将凝胶置电场中,在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移,迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。
在不同条件下电泳适当时间后,大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上,从而达到分离的目的。
琼脂糖凝胶的分离范围较广,用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。
5.化学合成的三种策略。
1)小片段粘接法:
将待合成的目的基因分成若干小片段,每段长12-15bp(碱基长度),两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片段,然后通过化学方法合成,并退火形成双链DNA大片段。
2)中片段法(补丁延长法):
将目的基因的一条链分成若干40-50bp大小的片段,另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片段(约20bp的补丁)。
两组不同大小的DNA单链片段退火后,用klenow酶将空缺部分补齐,最后用T4-DNA连接酶修复缺口。
3)大片段酶促法:
将目的基因两条链均分成40-50bp的单链DNA片段,分别进行化学合成,然后用klenow酶和T4-DNA连接酶补平。
6.化学合成法的特点和用途。
特点:
优点—反应快,操作简单;缺点—价格昂贵,大部分情况下仅限于小片段的合成。
用途:
合成PCR所需的引物;合成探针;合成接头;可合成新的人造基因。
7.什么是平台效应?
在PCR扩增反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,引物、模板、聚合酶达到一定比值时,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,也叫平台效应。
原因:
产物量增多、dNTP消耗殆尽、酶活趋于平稳。
8.PCR的五要素。
模板、引物、Taq酶、dNTP(4种)、Mg2+浓度。
9.PCR用途:
(1)基因分离、克隆
(2)扩增DNA靶序列并测序
(3)DNA靶序列的突变分析
(4)衡量DNA样品检测与分析。
四
1.引物设计的原则
(1)引物长度控制在15-30bp
(2)引物要是一对有相同的或相近的GC含量
(3)设计出的引物最好不要有其他的结合位点
(4)上下两条引物最好不要有互补区域
(5)引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个碱基,保证引物能够被切割
2.PCR没有获得目的产物或得到杂产物的原因
(1)没有获得目的产物
原因:
1.Taq酶少;2.退火温度过高;3.dNTP太少;Mgcl2太少;5.循环次数太少;6.模板太少或不纯;
解决方案:
1.多加Taq酶、dNTP、Mgcl2、模板;2.降低退火温度;3.纯化模板;4.增加循环次数
(2)得到杂产物
原
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