微生物限度检查操作规程2015版中国药典四部.docx

微生物限度检查操作规程2015版中国药典四部.docx

《微生物限度检查操作规程2015版中国药典四部.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物限度检查操作规程2015版中国药典四部.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

微生物限度检查操作规程（中国药典2015版四部通则）

一、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。

二、引用标准：

《中国药典》2015年版（通则1105-1106）

三、目录

1．微生物限度标准

2．设备、仪器及用具

3．消毒液、稀释剂、试液及培养基

4．检查总则（通则1105：

非无菌产品微生物限度检查：

微生物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：

控制菌检查法）

5．微生物计数法检查

6．控制菌检查法

7．实验技术

8.附件

1．微生物限度标准

非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准

（1）目测霉变者以不合格论。

（2）“无”为标准依据或无相应规定。

2．设施、仪器及用具

2.1设施

2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：

微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

2.1.2．其他设备：

高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30～35℃）；霉菌培养箱（25～28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250～300℃）；电冰箱。

生化试剂储存箱。

2.2仪器及器皿

2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。

2.2.2．玻璃器皿：

锥形瓶（250～300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，φ10～12cm）、培养皿（φ9cm）、量筒（100ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：

先用流水冲洗，浸泡于1%～2%盐酸（工业用）液中约2～6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。

用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次，晾干备用。

2.3用过的玻璃器皿

2.3.1未被病原微生物污染的器皿：

可随时洗涤。

用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。

容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次。

2.3.2试管及培养皿：

先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30分钟。

趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。

2.3.3吸管：

全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。

24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。

2.3.4载、盖玻片：

应分别浸泡于清洁液12～24小时后，取出用流水冲洗，再放入3%～5%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10～15分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。

沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。

2.3.5玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。

吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。

锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。

玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干备用。

2.4用具

2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。

2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。

也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。

2.4.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。

3消毒液、稀释剂、试液及培养基

3.1消毒液、稀释剂及试液。

3.1.10.1%苯扎溴铵溶液：

供洗手、擦拭操作台面用。

3.1.25%石碳酸溶液：

配制后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用，抑或选用其他适宜消毒液。

3.1.3．75%乙醇溶液：

配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。

3.1.4．0.9%无菌氯化钠溶液：

取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。

3.1.5．司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-80：

供非水溶性供试品供试液制备用。

3.1.6．无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：

取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10ml。

3.1.7．甲基红指示液：

取甲基红0.1g，加入95%乙醇300ml，水适量，使溶解，再加水至500ml。

3.1.8．V-P试液：

①氢氧化钾试液：

取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml；②α-萘酚乙醇试液：

取α-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100ml。

3.1.9．革兰染色液：

①沙黄染液：

取沙黄0.25g，加95%的乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml；②结晶紫染液：

取结晶紫1.0g，加95%的乙醇20ml，使溶解，加1%的草酸铵溶液80ml，混匀。

静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存；③碘试液：

取碘化钾2.0g，加水3~5ml使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后，加水稀释至300ml，置密

3.1.10．中性红指示液：

取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml，使溶解，再加水到100ml。

变色范围pH6.8～8.0（红→黄）。

3.1.11．亚甲蓝指示液：

取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100ml。

3.1.12．溴麝香草酚蓝指示液：

取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。

变色范围pH6.0～7.6（黄→蓝）。

3.1.13．酸性品红指示液：

以酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。

优点：

无色，在倒管内早期发酵易观察，不易被还原。

变色范围pH6.0～7.4（红→黄）。

3.1.14．曙红钠指示液：

取曙红钠2.0g，加水使溶解成100ml。

3.1.15．靛基质试液：

取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。

3.2培养基

3.2.1．培养基的制备及储存

3.2.1.1溶化：

一般应放在玻璃器皿或搪瓷器内。

加入纯化水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。

3.2.1.2在使用干燥培养基时，先将纯化水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置10～15分钟，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要加热，必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免某些营养成分被破坏。

3.2.1.3校正酸碱度：

培养基必须有适当的pH值。

测定pH值是培养基配制过程中的重要步骤之一，干燥培养基一般已校正过pH值，用时也必须再验证。

pH值测定时，一般用指示剂滴入培养基中观察其颜色的变化，或用pH计校正，如与所需pH值不符，可用酸或碱液加以校正。

一般用氢氧化钠校正的弱碱性培养基，高压灭菌前培养基的pH值高0.2左右，灭菌后基本合适。

调整pH值后要加热过滤，使培养基澄清。

3.2.2培养基的分装：

3.2.2.1液体、半固体培养基一般在高压灭菌前分装，约装试管容积的1/3，在灭菌后还要加入成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。

3.2.2.2固体培养基一般分装在250ml、500ml锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。

平皿：

如倾注平皿，应在无菌室中放置3～4小时，如用塑料平皿须在35℃培养箱中倒置30～60分钟。

水蒸气会自然蒸发。

斜面：

制备低层斜面分装于试管，约占容积的1/5，灭菌后趁热斜放于细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装时注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，避免污染。

制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。

3.2.3培养基的灭菌：

培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力，按其成分不同而定。

普通培养基多采用121℃、103.42kPa灭菌15分钟，但容器和装量较大时，可延长至20分钟。

高压灭菌应严格按照操作规程进行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的冷空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全杀灭微生物的目的。

检査方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。

4.2.2计数方法：

包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod,简称MPN法）。

MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。

供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。

所选方法的适用性须经确认。

计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。

供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。

若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。

4.2.3菌种及菌液制备

4.2.3.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

4.2.3.2计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见（表1）。

菌液制备按（表1）规定程序培养各试验菌株。

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加人3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用。

4.2.4阴性对照

为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

4.2.5培养基适用性检査

微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

按（表1）规定，接种不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1规定条件下培养。

每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。

4.3计数方法适用性试验

4.3.1供试液制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

常用的供试液制备方法如下（如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法）

4.3.1.1水溶性供试品取供试品，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或