RNA转录与转录后加工.docx
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RNA转录与转录后加工
第7章RNA转录与转录后加工
1本章主要内容
1)转录的基本概念
2)大肠杆菌RNA聚合酶及其转录
3)真核生物的RNA聚合酶及其转录
4)RNA的转录后加工和反转录
2教学目的和要求
通过本章学习,掌握转录的基本概念,原核转录的主要参与者(RNA聚合酶和启动子)以及原核转录的过程(起始、延伸和终止)。
1)掌握真核转录的三种主要RNA聚合酶、所转录的基因类型和参与转录过程各种因子等。
2)了解不同前体RNA的加工机制。
3)了解反转录的特点
3重点难点
1)转录
2)大肠杆菌RNA聚合酶、原核转录的过程
3)真核生物的RNA聚合酶、真核转录过程、转录因子
4)RNA的转录后加工、反转录
4教学方法与手段
讲授与交流互动相结合,采用多媒体教学。
5授课内容
1)RNA转录概述
2)细菌基因的转录
3)真核生物的转录
4)RNA的转录后加工
5)RNA的反转录
第一节RNA转录概述
一、信使的发现
•1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行实验:
–若加入RNA酶,则蛋白质合成就停止;
–若再加入来自酵母的RNA,又可合成蛋白质。
这表明什么?
•同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫RNA前体——
•发现标记的RNA在核内。
•标记追踪实验:
经过一段时间又发现被标记的RNA在细胞质中,
•这表明什么?
•1956年E.Volkin和L.Astrachan:
•用同位素脉冲一追踪标记
•表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和自身的DNA碱基比相似,而和细菌的碱基比不同。
T2感染细菌时注入的是DNA,而在细胞里合成的是RNA。
•这表明什么?
•最令人信服的证据是Hall.B.D和Spiegeman,S的DNA-RNA的杂交实验:
•将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离出来,分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交。
•结果这种RNA只能和T2的DNA形“杂种”链,而不能和E.coli的DNA进行杂交。
Jacob和Monod预言:
(1)这种“信使”应是一个多核苷酸;
(2)其分子平均不小于5105bp,足以携带一个基因的遗传信息;
(3)它们至少是暂时连在核糖体上;
(4)其碱基组成反映了DNA的序列;
(5)它们能高速更新。
Jacob和Monod将它定名为:
信使RNA(MessengerRNA)或mRNA。
二、几个基本概念
•转录(transcription):
是指以DNA为模板,在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下,以4种rNTP(ATP、CTP、GTP和UTP)为原料,合成RNA的过程。
•在有些病毒中,RNA也可以指导合成RNA。
•转录是基因表达的第一步,也是最关键的一步。
三、RNA合成的基本特点
•1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶(RNAPol)。
其特点是:
(1)以核糖核苷三磷酸(rNTR)为底物;
(2)以DNA为模板;
(3)按5′-3′方向合成;
(4)无需引物的存在能单独起始链的合成;
(5)第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在;
(6)在体内DNA双链中仅一条链作为模板;
(7)RNA的序列和模板是互补的。
确定有义链
•1963J.Marmur和DotySpiegelnan区分有义链。
采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料,SP8DNA双链有“轻”、“重”差异明显。
•现在将作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链(antisenstrand),
•非模板链称为有义链(sensestrand)或编码链。
•在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。
•怎样用实验证实mRNA的合成总是延着5’-3′方向进行的?
•E.coli在0C时需13秒钟才能加上一个核苷酸,但在37C每秒就可加上40个核苷酸;
•利用这个差别以14C来标记U,在0C培养E.coli,。
•提取这种正在伸长的mRNA分子,发现——
•14C标记首先出现在伸长的3′端,因此可以证明合成是延着5′-3′方向进行的。
四、RNA合成和DNA复制的区别
(1)转录时只有一条DNA链为模板,而复制时两条链都可作为模板;
(2)DNA-RNA杂合双链不稳定,RNA合成后释放,而DNA复制叉形成后一直打开,新链和母成子链;
(3)RNA合成不需引物,而DNA复制需引物;
(4)转录的底物是rNTP,复制的底物是dNTP;
(5)聚合酶系不同。
第二节细菌基因的转录
一、细菌的RNA聚合酶
1.全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnzyme)
(1)全酶(HoloEnzyme)
•用于转录的
•依靠空间结构与DNA模板结合(σ与核心酶结合后引起的构象变化)
•专一性地与DNA序列(启动子)结合
•结合常数:
1014/mol
•半衰期:
数小时(107/mol1秒以下)
•转录效率低,速度缓慢(σ的结合)
(2)核心酶(CoreEnzyme)
•作用于转录的延伸过程(终止)
•依靠静电引力与DNA模板结合(蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间)
•非专一性的结合(与DNA的序列无关)
•结合常数:
1011/mol
•半衰期:
60秒
E.ColiRNApol的亚基组成
coreenzyme
(3)全酶的组装过程
•此外,新发现的一种ω亚基的功能尚不清楚。
2.各亚基的特点和功能
(1)σ因子
•σ因子可重复使用
•修饰RNApol构型
•使HoloEnzyme识别启动子的SextamaBox(-35区),并通过σ与模板链结合
E.coli中不同的因子可识别不同的启动子
(2)α因子
•核心酶的组建因子
•促使RNApol与DNA模板链结合
•前端α因子--使模板DNA双链解链为单链
•尾端α因子--使解链的单链DNA重新聚合为双链
(3)β因子
•完成NMP之间的磷酸酯键的连接;
•Editing功能(排斥与模板链不互补的碱基);
•与Rho(ρ)因子竞争RNA3’-end;
•构成Holoenzyme后,β因子含有两个位点;
•Isite(initiationsite.Rifs):
该位点专一性地结合;
•ATP或者GTP(需要高浓度的ATP或GTP);
•Esite(elongationsiteRifR):
对NTP非专一性地结合(催化作用和Editing功能).
(4)β’因子
•参与RNA非模板链(sensestrand)的结合(充当SSB)
•有义DNA链结合位点(β’亚基提供)
•DNA/RNA杂交链结合位点(β亚基提供)
•双链DNA解链位点(前端α亚基提供)
•单链DNA重旋位点(后端α亚基提供)
•σ因子作用位点
原核生物RNApol(Core)的结构与功能
RNApol执行多种功能
(1)识别DNA双链上的启动子;
(2)使DNA变性在启动子处解旋成单链;
(3)通过阅读启动子序列,RNApol确定它自己的转录方向和模板链;
(4)最后当它达到终止子时,通过识别停止转录。
二、原核生物转录的起始延伸
1.启动子(promoter)的结构和功能
启动子(promoter):
是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域,它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。
启动子由两个部分组成
●上游部分—CAP-cAMP结合位点:
(基因表达调控的正控制位点)
CAP(catabolitegeneActivatorProtein)降解物基因活化蛋白,环腺苷酸(cAMP)的受体蛋白
●下游部分—RNApol的进入(结合)位点
-35~-10
包括识别位点和结合位点(RB位点)
2.RNA聚合酶的进入位点
(1)Sextama框(SextamaBox)
–-35序列,RNA聚合酶的松弛(初始)结合位点
–RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点,
为转录选择模板——识别位点(R位点)
–大多数启动子中共有序列为T82T84G78A65C54A45
–重要性:
很大程度上决定了启动子的强度(RNApol的σ因子)
(2)Pribonow框(PribonowBox)
•-10序列是由Pribnow和Schaller(1975)发现,故也称为Pribnow框盒(Pribnowbox)。
•-10序列,RNA聚合酶的牢固结合位点——结合位点(B位点)
•一致序列:
T80A95T45A60A50T9(TATPUAT),因此又称TATABox
•位置范围-4到-13
(3)转录起始位点(I)
•+1位点
•RNA聚合酶的转录起始位点
•转录开始时模板上的第一个碱基在原核中常为A或G
•而且位置固定
典型启动子的结构
3.起始过程
(1)全酶与模板DNA接触,生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动;
(2)起始识别:
全酶与-35序列结合,产生封闭的酶-启动子二元复合物(closedbinarycomplex);
(3)全酶紧密地结合在-10序列处,模板DNA局部变性,形成开放的启动子二元复合体;
(4)酶移动到I,第一个rNTP转录开始,σ因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体(ternarycomplex)。
图起始过程
图RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:
σ和1/3的RNApol结合成全酶,或在非特异位点的松散复合体中,或在启动子中的二元复合体中;
其中半数的核心酶从事转录;
余下的核心酶大量存在于闭合松散复合体中;
估计数量很少的全酶是游离的。
4.RNA链延伸
三原核生物转录的终止
1.终止子的种类
(1)不依赖ρ因子的终止子(内在终止子):
体外实验中,只有核心酶和终止子就足以
使转录终止
(2)依赖ρ因子的终止子:
蛋白质辅助因子
--ρ因子存在时,核心酶终止转录
两者有共同的结构特征(序列差异)
不依赖ρ因子的终止子(强终止子)
•结构特征:
☻一是形成一个发夹结构
茎….7~20bp的IR序列形成(富含G/C)
环….中间不重复序列形成
发夹结构的突变可阻止转录的终止
☻二是6~8个连续的U串(发夹结构末端)
、依赖ρ因子的终止子
结构IR序列中的G/C对含量较少
发夹结构末端没有固定特征
靠与ρ的共同作用而实现终止
2.原核生物转录的终止
(1)不依赖ρ因子的终止子终止转录
新生RNA链发夹结构形成造成高度延宕(典型的有60秒左右)
RNApol暂停为终止提供了机会,6~8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号
RNA-DNA之间的rU-dA结合力较弱
于是:
RNA-DNA解离→三元复合体解体
→RNApol解离→转录终止
真正的终止点不固定,在U串中的任何一处
IR序列和U串同等重要
IR中的G/C对含量的减少
U串的缩短或缺失
DNA上与U串对应的为富含A/T的区域
说明:
AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用
(2)依赖ρ因子的终止子终止转录
通读(readthrough):
ρ因子的转录终止过程中,RNApol转录了IR序列之后,虽发生一定时间的延宕,但如果没有ρ因子存在,则RNApol会继续转录
ρ因子
a、活性形式为六聚体
促进转录终止的活性,NTPase活性
b、RNA长度大于50nt时,依赖RNA的NTPase活性最大
说明:
ρ因子识别和结合的是RNA
ρ因子对终止子的作用
a、ρ因子与RNA结合(终止子上游的某一处,RNA的5’端)
b、ρ因子沿RNA从5’→3’移动(NTP水解供能)(终止子处的较长时间的延宕给ρ因子追赶的机会)
c、ρ因子与RNApol相互作用而造成转录的终止
RNAPol转录DNA
●ρ因子附着到RNA识别位点上
●ρ因子跟在RNAPol后沿RNA移动
●RNAPol在终止位点停下,并被ρ因子追上
●在转录泡中ρ因子使DNA-RNA杂种双链解开
●转录终止,释放出RNAPol,ρ子和RNA
终止反应还需要RNA与DNA的相互作用
•即:
需要一定的RNA序列
•因为:
其与模板的结合力必须弱到一定数
值,才能配合ρ因子与RNApol的作用
(发夹结构下游的AU序列)
•序列不同的终止子→不同的终止程度→基因表达调控的途径之一
要点回顾
◆几个基本概念
5’----GCAGTACATGTC-----3’编码链DNA
3’----CGTCATGTACAG-----5’模板链
5’----GCAGUACAUGUC-----3’mRNA
N-----Ala--Val--His--Val------C蛋白质
Ø不对称转录
1.DNA双链上,一股链可转录,另一股不转录。
2.有意义链与反意义链并非固定不变。
3.转录方向都是5’→3’
◆原核生物的RNA转录
Ø原核生物RNA聚合酶
大肠埃希菌RNA聚合酶的组成
(1)全酶(holoenzyme)
由4种(5个)亚基α2ββ’σ组成
(2)核心酶(coreenzyme)
α2ββ’,参与转录的全过程
(3)σ亚基
亦称σ因子(σfactor)—转录辅助因子
识别启动子,不参与转录过程
Ø转录过程(起始、延长、终止)
ÐDNA模板
启动子(promoter)
1)概念:
转录开始时能与RNA全酶结合的DNA顺序(双链)
2)原核生物启动子的特点:
①DNA序列在转录起始点的5’端区(上游区)
②-10bp处-TATAAT-(Pribnowbox)
③-35bp处-TTGACA-(SextamaBox)
Ð起始过程
v封闭的酶-启动子二元复合物(closedbinarycomplex);
v开放的启动子二元复合体(openedbinarycomplex);
v酶-启动子-rNTP三元复合体(ternarycomplex)。
Ø终止
终止的方式
•ρ-因子的作用
•与新生RNA结合
ATP供能
ρ-因子沿新生的RNA单链推进
新生的RNA单链从DNA模板上分离下来
第3节真核生物的转录
一真核生物的RNApol
1.真核生物的RNApol
2.位置和转录产物
●RNApolⅠ核仁活性所占比例最大转录rRNA(7.8S、18S、28S)
●RNApolⅡ核质主要负责hnRNA、snRNA的转录
•hnRNA(mRNA前体,核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA)
•snRNA(核内小分子RNA,smallnulearRNA)
表6-2真核生物的三种RNA聚合酶的特点
RNAPol
位置
产物
相对活性%
对α-鹅膏蕈敏感
PolⅠ
核仁
28S,18S,7.8SrRNAs
50~70
不敏感
PolⅡ
核质
hnRNA,mRNA,某些SnRNA
20~40
高度敏感
PolⅢ
核质
tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs
~10
片段特异,中等敏感
3.亚基组成:
•RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都由多个亚基组成。
有些亚基是三种酶所共有。
•mRNA是各种RNA中寿命最短、最不稳定的,需经常重新合成。
因此RNA聚合酶Ⅱ是三种酶中最活跃的。
表6-3真核生物聚合酶的成分及功能
4.RNApolⅡ亚基组成:
分子量500KDa,含两个大亚基和7~12个小亚基
●大亚基中有C末端结构域(carboxyterminaldomain,CTD)
●CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复
●Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
C端重复七肽,
●不同生物中重复数目不一样(酶活性)
二真核生物的启动子
三种RNApol→三种转录方式
三种启动子→三类基因,Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ类
•1、RNApolⅡ的启动子——Ⅱ型启动子
•2、RNApolⅠ的启动子——Ⅰ型启动子
•3、RNApolⅢ的启动子——Ⅲ型启动子
1.RNApolⅡ的启动子
即Ⅱ型启动子
•结构最复杂
•位于转录起始点的上游,由多个短序列元件组成
•通用型启动子(无组织特异性)
(1)帽子位点(capsite):
转录起始位点
(2)TATA框(Hogness框或Goldberg-Hogness框)
•位于-30处
•一致序列为T82A97T93A85A63(T37)A83A50(T37)
•定位转录起始点的功能(类似原核的Pribnow框)
•TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的。
(3)CAAT框(CAATbox)
(4)增强子(enhancer)
(5)GC框(GCbox)
•位于-90附近,较常见的成分
•核心序列为GGGCGG
•可有多个拷贝,也可以正反两方向排列
(6)其他元件:
•八聚核苷酸元件(octamerelementOCT元件)
一致序列为ATTTGCAT
•B元件一致序列为GGGACTTTCC
•ATF元件一致序列为GTGACGT
•还有一些位于起始点下游的相关元件
(7)不同元件的组合情况
不同元件的数目、位置、和排列方向均有差异,例如:
SV40的早期启动子中有6个GC框。
真核生物启动子示意图
RNApolⅡ的启动子小结:
★不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同
★不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交启动子功能没有变化
★各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上,组成起始复合物,蛋白因子间的相互作用决定了转录的起始
2.RNApolⅠ启动子
•即Ⅰ型启动子,由2部分保守序列组成:
•核心启动子(corepromoter)或核心元件(coreelement),位于-45到+20,负责转录的起始。
•上游控制元件(upstreamcontrolelement,UCE),从-180延伸到-107,
可增加核心元件的转录起始的效率。
3.RNApolⅢ启动子
(1)分为二类,每种识别方式不同
a、下游启动子(内部启动子)
位于转录起始点的下游
5SRNA和tRNA基因
可分为两类
b、上游启动子snRNA
(2)内部启动子的发现
最早发现于非洲爪蟾的5SrRNA基因
试验设置:
★非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系,进行缺失试验
★以不同长度的5SrRNA基因为模板进行转录。
结果:
缺失+55以前和缺失+80以后的序列都能正常转录,缺失+55到+80序列不能转录。
结论:
★5SrRNA基因的启动子位于基因内部
★该启动子可使RNApolⅢ在其上游的55bp处起始转录
(3)内部启动子分为两类
均含两个短序列元件,中间由其他序列隔开
第一类:
含A框和C框(5SrRNA基因)
第二类:
含A框和B框(tRNA基因、VARNA基因)
间隔序列长短差异很大
☻其中内部启动子起被RNApolⅢ识别的作用
图6-23真核RNAPolⅢ的基因内启动子和基因外启动子
三真核生物转录的起始
♫三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力
♫转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子)参与,并且按一定顺序与DNA形成复合物,协助RNApol定位于转录起始点。
★RNA聚合酶Ⅱ催化的转录起始
•RNA聚合酶Ⅱ催化各种前体mRNA的合成
•需要多种TF参与:
TFⅡA-J
•真核生物的转录起始是在转录因子(TF)的协助下,RNA聚合酶辨认结合转录起始点上游的DNA序列(启动子),生成起始前复合物。
RNApolⅡ的转录起始
★RNApolⅠ的转录起始
•需要二种辅助因子:
UBF1、SL1
★RNApolⅢ的转录起始
表6-6RNApolⅢ启动子的转录因子的结构和功能
因子
结构
功能
TFⅢA
38Kda,有9个锌指
结合于1型内部启动子(5sRNA基因)的C框,使ⅢC结合在C框下游,辅助ⅢB定位结合
TFⅢB
含TBP和另外二种蛋白
定位因子,使Pol结合在起始位点上
TFⅢC
含τA和τB,有5个亚基
τB结合Ⅱ型内部启动子(tRNA基因)的B框,起增强子的作用。
τA结合A框,起启动子的作用;辅助ⅢB定位结合
TBP
是B,ⅡD,SL1的亚基
和特异DNA序列及RNAPol结合,使Pol结合,在正确的位点上
TFⅡD
含TBP亚基
结合TATA框,确定选择PolⅢ
PBP
次近端结合蛋白
可能和ⅡD一道辅助ⅢB定位结合的另一途径
☻TBP的作用
★所有RNApol的转录起始都需要TBP
★在RNApolⅠ的转录起始过程中,TBP是SL1的组份,起定位RNApolⅠ的作用
★RNApolⅡ的转录起始由TBP识别TATA框
★在RNApolⅢ的转录起始过程中,TBP起定位RNApolⅢ的作用
☻TBP起定位作用,所以又称定位因子(positioningfactor)
四转录延伸TranscriptionElongation
1.起始到延伸的转变
★始于第一个磷酸二酯键的形成
★伴随着DNA分子和酶分子构象的变化
(1)Prok.
•起始时,σ因子有利于β和β’亚基具有与DNA专一性结合所要求的构象
•起始后,σ因子解离,β和β’亚基构象发生变化
(2)Euk.多种辅助因子的共同作用来保证这一转变
2.延伸过程
Prok.
★酶与产物RNA不解离
★底物NTP不断加到RNA链的3’-OH端
★形成一个磷酸二酯键后,核心酶向前滑动
★延伸位点不断地接受新的NTP,RNA链不断延伸
☻始终保持三元复合物的结构
转录泡
●RNApol结合和转录的DNA模板区域,有17bp左右
●DNA形成解链区
●转录泡处杂交双链很短
─胰脏RNAase——其长度10bp(不准确)
─推测也就两个核苷酸左右
拓扑学问题
ΦRNA合成过程中,
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- RNA 转录 加工