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药物分析实验
实验1用酸度计测定药物液体制剂的pH值...........................2
实验2原料药品吸收系数的测定....................................5
实验3气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定...................7
实验4反相液相色谱中影响溶质保留值的主要因素....................10
实验5药物特殊杂质检查..........................................12
实验6盐酸利多卡因含量的测定(非水滴定法)......................13
实验7布洛芬的紫外分光光度法和红外光谱法鉴别....................14
实验8盐酸普鲁卡因注射液的分析..................................15
实验9维生素E胶丸的气相色谱测定.................................16
实验10阿司匹林胶囊中水杨酸的限量测定(柱分配色谱—紫外分光光度法)18
实验11注射用青霉素钠的含量测定(高效液相色谱法)..................20
实验12维生素B1片剂的含量测定(差示分光光度法).................21
实验1用酸度计测定药物液体制剂的pH值
一、目的要求
1.通过实验加深对用pH计测定溶液pH的原理的理解
2.掌握用酸度计测定溶液pH值的方法。
二、原理
直接电位法中测定pH值,目前是以玻璃电极为指示电报,将它作为负极;饱和甘汞电极(SCE)为参比电极(正极),插人溶液中,构成原电池。
(-)Ag,AgCl(s)︱HCI(0.1mol/L)︱H+(xmol/L)‖KCI(饱和)︱Hg2Cl2,Hg(+)
该电池的电动势为:
上式表明,测得的电池电动势(E)与溶液的pH呈线性关系,其斜率为
,该值随温度的改变而变化,因此pH计上都设有温度调节钮来调整温度。
在实际工作中由于K值受不对称电位的影响,其值不易准确求得,故酸度计测量pH值时,往往采用两次测量法。
即先用标准缓冲溶液来校正pH计(即“定位”),则
两式相减,得:
在校正时,应选用与被测溶液pH值接近的标准缓冲溶液,以减少测定过程中由于残余液接电位而引起的误差。
有些玻璃电极或酸度计的性能可能有缺陷,测定溶液pH之前要用两种不同pH值的缓冲溶液进行校正,在用一种的pH值的缓冲溶液定位后,测定相差约3pH单位的另一缓冲溶液的pH时,误差应在±0.1pH之内。
应用校正过的酸度计,就可直接测量待测溶液的pH值。
三、仪器与试剂
1仪器酸度计,玻璃电极及甘汞电极(或玻璃复合电极),塑料烧杯或玻璃烧杯(50ml)。
2试剂邻苯二甲酸氢钾标准缓冲溶液(0.05mol/LpH値4.00),混合磷酸盐标准缓冲溶液(0.025mol/L6.86),硼砂(0.01mol/LpH値9.18);注射用葡萄糖溶液和生理盐水。
四、实验内容
1按照所使用的酸度计说明书的操作方法进行安装和操作
2实验测量
校正:
(1)调节温度补偿旋钮,使其数值等同于待测溶液的温度。
(2)将电极置于第一个标准pH缓冲液内,调节标定位钮使仪器读数等同于标准pH缓冲液的标示值。
(3)将电极置于另一个标准pH缓冲液内,调节斜率钮使仪器读数等同于标准pH缓冲液的标示值。
测定:
用校准过的pH计测定注射用葡萄糖溶液和生理盐水,各读取测定的pH值3次。
3测定完毕,洗净电极和烧杯,仪器还原,并关闭仪器电源。
五、结果处理
按测定的3次的葡萄糖溶液和生理盐水的pH值,求其平均值。
六、注意事项
(1)玻璃电极下端的玻璃球很薄,切忌与硬物接触,电极插头和电极插孔应保持清洁干燥,注意防尘、防潮和防腐蚀。
(2)玻璃电极使用前,应将玻璃球部位浸泡在蒸馏水中至少一昼夜。
若在50℃蒸馏水中保温2h,冷却至室温后可当天使用,不用时也最好浸泡在蒸馏水中,供下次使用。
(3)用玻璃电极测定碱性溶液时,尽量快速测量,对于pH>9的溶液的测定,应使用高碱玻璃电极(如231型玻璃电极)。
若使用有钠差电极测定时,应校正碱差。
在测定胶体溶液、蛋白质和染料溶液后,玻璃电极宜用软纸或棉花沾乙醚小心地轻轻擦拭,然后用酒精清洗,最后用蒸馏水洗净。
如果电极上沾有油污,应先浸人酒精中,然后移到CCl4或乙醚中,再移置酒精中,最后用蒸馏水浸泡。
(4)使用甘汞电极时,应先把电极管侧面小橡皮塞及弯管下端的橡皮套取下,以借助于重力,使管内的KCl液能渗漏扩散至被测液。
甘汞电极不能在60℃以上的环境中使用,也不能长时间地浸泡在待测液里。
(5)饱和甘汞电极应避免下端瓷芯被阻塞,溶液中应有少许KCI晶体存在,但弯管内不得有气泡将溶液隔断,以免阻断电极的回路。
(6)安装电极时,应使玻璃电极下端较甘汞电极稍高2~3mm,以防止玻璃电极碰触烧杯底而破损。
也要使甘汞电极中KCI溶液的液面与待测液液面有一液位差,避免待测液向甘汞电极中扩散。
甘汞电极不用时,要将下端毛细管口用橡皮套套住,注意不要使饱和KCl溶液晾干。
(7)校准仪器时,应尽量选择与待测液pH值接近的标准缓冲液(ΔpH<3)。
两溶液温度差要小于1℃。
校准仪器的缓冲液,采用单一的碱性或酸性盐所配的溶液较好。
用的试剂要纯,碱性盐(如硼砂)易风化和吸收空气中的CO2需重结晶才能使用。
精密度为0.01的pH计,硼砂应在饱和氯化钠一蔗糖溶液做成的恒湿器(70%湿度)中保存。
配制缓冲溶液时,宜用新煮沸且冷却的蒸馏水配制。
保存时宜用聚乙烯塑料瓶,盖子若不严密可用蜡封口。
(8)对于弱缓冲溶液(如H2O)的pH值测定,选用邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液校准后,测定样品溶液,并重取样品液再测,直至读数在1min内的改变不超过0.05pH为止。
然后再用硼砂标准缓冲溶液校正仪器,再如上进行测定,两次读数之差不超过士0.1pH。
取两次读数的平均值即是该溶液的pH值。
(9)酸度计使用完毕后,电源开关应置“关”处,量程选择钮置于“0处。
仪器应置于干燥环境,并防止灰尘及腐蚀性气体侵人。
七、思考题
(1)标准缓冲溶液的pH值受哪些因素影卿如何保证其pH值不变?
(2)为什么校准酸度计要用与待测液pH值相近的标准缓冲溶液?
(3)一种缓冲溶液是一个共轭酸碱的混合物,那么,邻苯二甲酸氢钾、硼砂为什么也可看作为一种缓冲溶液?
(4)电极安装时,应注意哪些问题?
实验2原料药品吸收系数的测定
一、目的要求掌握测定原料药品吸收系数的知识和操作方法。
二、原理
根据药品的分子结构,确定药品是否有紫外收收光谱。
如果有,则配制一个溶液,使其浓度于最大吸收波长处的吸收度在0.2~0.7之间。
测定完整的吸收光谱,找出干扰小且能较准确测定的最大吸收波长。
然后再配制准确浓度的溶液在选定的吸收峰波长处测定吸光度。
按
式计算其吸收系数。
欲测定吸收系数的药品,必须重结晶数次或用其他方法提纯,使熔点敏锐、熔距短,在纸上或薄层色谱板上色谱分离时,无杂斑。
此外,所用分光光度计及天平、祛码、容量瓶、移液管都必须按鉴定标准经过校正,合乎规定标准的才能用于测定药品的吸收系数。
药品应事先干燥至恒重(或测定干燥失重,在计算中扣除)。
称重时要求称量误差不超过0.2%,例如称取10mg应称准至0.02mg,测定时应同时称取2份样品,准确配制成吸光度在0.7~0.8的溶液,分别测定吸收度,换算成吸收系数。
两份间相差应不超过1%。
再将溶液稀释1倍,使吸收度在0.3~0.4之间,同上测定、换算,2份间差值亦应在1%以内。
按浓溶液和稀溶液计算的吸收系数之间差值也应在1%以内。
药品的吸收系数经5台以上不同型号的紫外分光光度计测定,所得结果再经数理统计方法处理,相对偏差在1%以内,最后确定吸收系数值。
本实验以原料药扑尔敏的吸收系数测定为例,了解药品吸收系数测定的知识和操作方法。
三、仪器与试剂
1仪器5台以上不同型号的紫外分光光度计,容量瓶(100ml,50ml),移液管((l0ml,5ml),洗耳球。
2试剂扑尔敏分析纯,在105℃干燥至恒重;H2SO4溶液(0.05mol/L}。
四、实验内容
(1)溶液的配制
用于称量的天平、砝码与配制溶液的容量瓶、移液管等仪器都需预先经过校正。
所用溶剂须先测定其空白透光率,应符合规定。
取在105℃干燥至恒重的扑尔敏纯品约0.01500g,精密称定,同时称取2份。
分别用H2S04溶液(0.05mol/L)溶解,定量转移至100ml容量瓶中,用H2S04溶液(0.05mol/L)稀释至刻度,得标准溶液(I)及(II)。
标准溶液(I)及(II)作为两组,每组各取3只50ml容量瓶,用移液管分别加入5.00ml和10.00ml扑尔敏标准溶液于两只容量瓶中,另1只容量瓶作空白,分别用H2S04溶液(0.05mol/L)稀释至刻度,摇匀。
2)吸收系数的测定
(1)首先找出吸收峰的波长以H2SO4溶液(0.05mol/L)为空白,测定扑尔敏标准溶液吸收峰的波长(在扑尔敏λmax264nm前后测几个波长的吸收度,以吸收度最大的波长作为吸收峰波长)。
(2)测定溶液的吸收度用已经校验过的紫外分光光度计进行测定,以选定的吸收池盛空白溶液,用已测出校正值的另一吸收池盛样品溶液,在选定的吸收峰波长处按常规方法测定吸收度。
用上述选定的吸收峰波长,分别测定2份样品浓、稀溶液共4个测试溶液的吸收度,减去空白校正值为实测吸收度值。
五、数据处理
(1)药品浓、稀溶液的吸收系数按下式计算:
(2)计算同一组浓、稀溶液的吸收系数,其差值应在1%以内。
(3)计算5台不同型号紫外分光光度计上测定的吸收收系数,其差值亦应在1%以内。
六、注意事项
1.样品若非干燥至恒重,应扣除干燥失重,即样重=称量值×(1一干燥失重%)。
2.测定样品前,应先检查所用溶剂在测定样品所用波长附近是否有吸收(要求不得有干扰吸收峰)。
用1cm石英吸收池盛溶剂,以空气为空白测定其吸收度。
在220~240nn范围内,溶剂和吸收池的吸收度不得超过0.40,在241~250nm范围内不得超过0.20,在251~300nm范围内不得超过0.10,在300nm以上时不得超过0.050。
3.将浓溶液稀释1倍时,应用同一批号溶剂稀释。
4.如遇易分解破坏的品种,在保存时应考虑密封充氮熔封。
七、思考题
1.测定药品吸收系数时,先配制某一浓度的溶液测其吸收度,然后稀释1倍后再测其吸收度。
根据浓、稀两溶液吸收度换算所得吸收系数的差值不得大于1%,为什么?
2.吸收系数值在什么条件下才能成为一个普遍运用的物理常数?
要使用吸收系数作为测定的依据,需要哪些实验条件?
3.确定一个药品的吸收系数为什么要有这么多的要求?
它的测定和使用涉及哪些主要因素?
4.比吸收系数与摩尔吸收系数的意义和作用有何区别?
怎样换算?
将你测得的比吸收系数换算成摩尔吸收系数。
为什么摩尔吸收系数的表示方法常取3位有效数字或用其对数值表示?
实验3气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定
一、目的要求
1.了解气相色谱仪的基本结构、工作原理与操作技术;
2.学习选择气相色谱分析的最佳条件,了解气相色谱分离样品的基本原理;
3.掌握根据保留值,作已知物对照定性的分忻方法。
4.掌握归一化法测定混合物各组分的含量。
二、基本原理
气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。
由于物质的物性不同,其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同,当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时,组份就在其中的两相间进行反复多次分配,由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同,虽然载气流速相同,各组份在色谱柱中的运行速度就不同,经过一定时间的流动后,便彼此分离,按顺序离开色谱柱进入检测器,产生的讯号经放大后,在记录器上描绘出各组份的色谱峰。
根据出峰位置,确定组分的名称,根据峰面积确定浓度大小。
三、仪器和试剂
1.气相色谱仪SP6800,N2000色谱工作站
2.氮气钢瓶,氢气发生器,空气压缩机
3.微量进样器10μL
4.色谱条件色谱柱:
苯系物专用检测柱(2mm×2m不锈钢填充柱,其最高耐受温度105℃),气化室温度:
150℃,检测器温度:
150℃,载气(N2)流速:
30~50mL/min,燃烧气(H2)流速:
40~50mL/min,助燃气(空气)流速:
400~500mL/min,柱温:
65℃~100℃。
初始色谱条件:
气化室温度:
150℃,检测器温度:
150℃,载气(N2)流速:
30mL/min,燃烧气(H2)流速:
40mL/min,助燃气(空气)流速:
400mL/min,柱温:
65℃。
5.苯、甲苯、乙苯、正己烷等均为分析纯。
四、实验内容
1.样品的配制:
分别取取苯、甲苯及乙苯各50μL,用正己烷稀释至50mL容量瓶中,密封摇匀。
2.样品的测定:
先按照初始条件设定色谱条件,待仪器的电路和气路系统达到平衡,记录仪上的基线平直时,即可进样。
吸取2uL标准样品注入汽化室,记录色谱图,采集色谱数据。
重复进样两次。
3.柱温的选择:
改变柱温:
65℃、75℃、85℃,同上测试,判断柱温对分离的影响。
4.载气流速的选择:
改变不同的载气流速,同上测试,判断载气流速对分离的影响。
五、数据及处理
1.记录初始实验条件下的色谱条件及色谱结果(各自组分及对应保留时间)。
并根据单一标准样的保留时间确定混合样品中各峰的物质名称。
记录实验条件:
(1)色谱柱的柱长及内径:
(2)载气及其流量:
(3)燃气及其流量:
(4)助燃气及其流量:
(5)柱温:
(6)检测器及检测温度:
(7)汽化室温度:
记录各色谱图上各组分色谱峰的保留时间值,并填入下表中。
编号
t苯
t甲苯
t乙苯
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
单标
混合样
2.采用混合标样作为样品,改变柱温:
65℃、75℃、85℃,同上测试,记录各色谱图上各组分色谱峰的保留时间值,并填入下表中。
判断柱温对分离的影响。
温度
t苯
t甲苯
t乙苯
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
60℃
65℃
70℃
75℃
80℃
六、注意事项
1.开机前检查气路系统是否有漏气,检查进样室硅橡胶密封垫圈是否需更换。
2.开机时,要先通载气后通电,关机时要先断电源后停气。
3.柱温、气化室和检测器的温度可根据样品性质确定。
一般气化室温度比样品组分中最高的沸点再高30-50℃即可,检测器温度大于柱温。
4.用FlD时,不点火严禁通H2,通H2后要及时点火,并保证火焰点着。
5.用TCD时.为保护检测器,应先通载气再加电桥电流。
TCD的灵敏度与桥流的三次方成正比,因此可提高桥流增加TCD的灵敏度。
但桥流不得超过允许值,最大允许桥流与热丝材质、载气种类、检测器温度有关。
6.使用10ul注射器注样时,切勿用力过猛,以免把针芯顶弯。
不要用手接触针芯。
7.仪器基线平稳后,仪器上所有旋钮、按键不得乱动,以免色谱条件改变。
8.定量吸取样品,注射器中不应有气泡。
9.微量注射器使用前应先用被测溶液洗涤5次,实验结束后应用乙醇清洗干净。
10.计算理论塔板数及分离度时,tR与W1/2,W的单位要一致,将距离单位换算成时间单位:
W1/2(mm)/纸速(mm/min).
七、思考题
1.气相色谱定性分析的基本原理是什么?
本实验中怎样定性的?
2.试讨论各色谱条件(柱温等)对分离的影响。
3.本实验中的进样量是否需要准确,为什么?
4.简要分析各组分流出先后的原因。
注:
苯、甲苯、乙苯的密度分别取以下值(20℃):
苯的密度:
0.879g/mL,甲苯的密度:
0.865g/mL,乙苯的密度:
0.867g/mL
实验4反相液相色谱中影响溶质保留值的主要因素
一、目的要求
1熟悉仪器的操作方法。
2了解样品的结构;溶剂M成对样品的热力学保留值的影响。
3了解溶剂组成对同系物的选择性影响。
二、原理
在反相系统里,固定相是非极性的(亲脂性),流动相是极性的(亲水性)。
在化学键合相色谱中,反相固定相的配合基常常是链长2-18碳原子的烷基,流动相一般为极性的有机改性剂和水的混合溶剂,如甲醇和水。
反相色谱的保留机理,一般认为是固定相表面的非极性部分(烷基)与溶质分子的非极性部分缔合,称为疏溶剂作用(疏水效应)。
反相色谱的分离是以溶质的疏水结构的差异为基础。
溶质极性越大、溶质分子中非极性部分表面积越小,则保留值越小。
两个相邻同系物的相对保留值即分配系数比α随洗脱液极性的降低而减小。
三、仪器与试剂
1仪器高效液相色谱仪(LC-1000),紫外检测器,N2000色谱工作站,过滤和脱气装置,C18反相键合色谱柱(200mm×Φ4.6mm),微量注射器(100μl)。
2试剂苯、甲苯、乙苯、正丙苯、正丁苯(均为A.R)、甲醇(色谱纯),新鲜的二次蒸馏水。
四、实验内容
1样品结构对保留值的影响
①配制苯、甲苯、乙苯、正丙苯、正丁苯的甲醇混合溶液作为试样。
②配制流动相甲醇:
水=90:
10,然后过滤并脱气。
③色谱条件流动相:
甲醇:
水(90:
10),固定相:
C18反相键合色谱柱(200mm×Φ4.6mm),检测波长:
254nm,流量:
1mL/min,进样量:
20μl。
④启动泵,排出流路中气泡;打开计算机点击online启动工作站;打开紫外检测器,在室温下,待基线平稳后进样,记录色谱图1。
2流动相组成对保留值的影响
①配制苯、甲苯的甲醉溶液作为试样。
②配制流动相组成分别为(Ⅰ)甲醇:
水=90:
10;(Ⅱ)甲醇:
水=80:
20;(Ш)甲醇:
水=70:
30;(Ⅳ)甲醇:
水=60:
40
③依次更换流动相(I),(II),(Ш),(Ⅳ),在每个体系中,待基线平稳后,分别进样,记录色谱图2至5。
实验结果填入下表。
五、结果处理
(1)根据色谱图1,计算各组分的容量因子
值,并绘制lgk=f(nc)曲线。
(nc为同系物的碳原子数)。
(2)记录实验结果如表1
表1实验数据处理
流动相:
甲醇/水
苯
甲苯
α
tR
k
tR
k
90:
10
80:
20
70:
30
60:
40
根据色谱图2~5和上表,绘制lgk-f(H2O%)曲线及α-H20%曲线。
六、注意事项
(1)更换流动相时,需停泵操作,以防止气泡进人。
(2)更换试样时,注射器应先用甲醇或丙酮清洗数次,再用新试样清洗几次。
(3)正确使用进样阀。
七、思考题
1什么是正相色谱?
什么是反相色谱?
2反相色谱最常用的流动相是什么?
3何时采用梯度洗脱?
差示折光检测器和紫外检测器可否用于梯度洗脱?
4A,B,C三组同学用3种不同比例的流动相在同一仪器上分析苯和蔡,测得二者的分离度分别为1.0,1.5,2.0,请问哪组同学选用的流动相较适宜?
5在反相柱上分离3个相邻的同系物,初试未达到完全分离。
如何实现完全分离?
保留值如何变化?
实验5药物特殊杂质检查
一、目的要求
1.掌握本实验中药物特殊杂质检查原理。
2.熟悉薄层色谱法用于特殊杂质检查的一般操作。
3.了解本实验中药物特殊杂质的来源和检查目的。
二、基本原理
醋酸氟轻松中其他甾体的检查甾体激素药物多由甾体母体或结构类似的其他甾体激素经结构改造而来,因而可能带来原料、中间体、异构体、降解产物等杂质。
其中一些杂质与该甾体激素药物结构类似,也具有一定的药理作用而又互不相同。
这就使得在甾体激素药物中规定其他甾体或有关物质的限度检查显得非常必要,成为甾体激素药物纯度检查的一个重要项目,作为检查方法,TLC为各国药典所采用。
其原理是利用药物与杂质吸附或分配性质的差异将其分离,同时又可以检测。
三、仪器与试剂
5μL微量注射器,层析缸,喷雾器,醋酸氟轻松,三氯甲烷,甲醇,碱性四氮唑蓝,硅胶G,50mL容量瓶,1mL移液管
四、实验内容
醋酸氟轻松中其他甾体的检查
取本品,加三氯甲烷-甲醇(9:
1)溶解并制成每1mL中含3mg的溶液,作为供试品溶液。
精密量取1mL,置50mL容量瓶,加三氯甲烷-甲醇(9:
1)稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。
照薄层层析法试验,吸取上述两种溶液各5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇(97∶3)为展开剂,展开后,晾干,在105℃干燥1Omin,放冷,喷以碱性四氮哇蓝试液(称取0.2%四氮唑蓝的甲醇溶液lOmL与12%氢氧化钠的甲醇溶液30mL,临用时混合即得),立即检视,供试品溶液如显杂质斑点,不得多于2个,其颜色与对照溶液的主斑点比较,不得更深。
五、操作注意事项
1进行TLC时,应距底边2.5cm处点样,而且应该少量多次点于同一原点处,原点面积应尽量小;一般采用倾斜上行法展开,展开剂应浸人薄层板或层析滤纸底边约0.5-lcm深度;展开后必须晾干后才能继续进行显色等操作。
2碱性四氮唑蓝试液应临用新配。
六、思考题
1.如何选择设计药物中特殊杂质检查方法?
2.薄层层析法进行特殊杂质检查有几种方法?
本实验中醋酸氢化可的松中其他甾体的检查属于哪种方法?
该方法有何特点?
应用该方法时应注意什么?
3.试计算本实验中药物的杂质限量。
实验6盐酸利多卡因含量的测定
(非水滴定法)
一、目的要求
1.熟悉非水滴定的方法。
2.掌握非水滴定的测定原理。
二、实验原理
生物碱类药物通常具有弱碱性,在水溶液中用酸直接滴定由于没有明显的突跃,常不能获得满意的结果,而在非水酸性介质中,只要在水溶液中的Kb值大于10-10,都能被冰醋酸均化到溶剂Ac-水平,碱强度显著增强。
生物碱盐类的滴定过程,实际上是一个置换滴定,即强酸滴定液置换出与生物碱结合的较弱的酸。
盐酸利多卡因侧链烃胺的叔胺氮具有弱碱性,因此可采用非水溶液滴定法测定含量。
三、仪器与试剂
1仪器分析天平(万分之一),微量滴定管(10mL),锥形瓶(50mL),量筒(10ml)。
2试剂盐酸利多卡因(药用品),0.1000mol/LHClO4标准溶液,冰醋酸(A.R),醋酸汞(A.R),邻苯二甲酸氢钾(基准试剂),0.5%结晶紫冰醋酸指示液。
四、实验内容
取本品约0.2g,精密称定,加冰醋酸10mL溶解后,加醋酸汞试液(称醋酸汞5g,研细,加温热的冰醋酸使溶解成100mL,即得)5mL与结晶紫指示液(取结晶紫0.5g,加冰醋酸100mL使溶解,即得)1滴,用高氯酸滴定液(0.lmol/L)滴定至溶液显绿色,并将滴
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