链霉亲和素荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应.docx
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链霉亲和素荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应
链霉亲和素-荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用
摘要
本论文研究采用PCR的方法从实验构建的pUC57-sa质粒上经过扩增得到链霉亲和素基因片段,并成功构建出pETDuet-sa质粒,从而制备出核心SA。
然后,将大肠杆菌作为宿主,使pCDFDuet-ho1-pebB、pG-cpeS、pACYCDuet-pebA、pET30a(+)-sa-cpcB这4种质粒实现共表达,得到合成的SA-CpcB-PEB(融合色素蛋白)。
下一步,我们用购买的CEA与SA-RPE实验,试验藻胆蛋白荧光探针应用于(BSA)荧光免疫检测体系检测的可行性。
同时,用自制蛋白及SA-RPE,涉及在不同的实验条件下;孵育时间、缓冲液、实验素材的加入方式等,研究荧光免疫检测体系的相对合适的实验操作,实验结果显示,最好的实验条件是37℃下,1.5小时的孵育时间,一抗、二抗与荧光探针一次加入。
本次实验采用的方法来合成融合色素蛋白,具有便捷、低成本的特点,为以后将融合色素蛋白应用于食品检测、医学检验以及环境污染监测提供了很好的技术基础。
关键词:
链霉亲和素;藻胆蛋白;荧光探针;免疫检测
ABSTRACT
Inthispaper,thePCRmethodwasusedtoobtainstreptavidaffinitygenefragmentfromtheplasmidpuc57-saconstructedintheexperiment,andthepetduet-saplasmidwassuccessfullyconstructedtopreparethecoresa.Then,escherichiacoliwasusedasthehosttorealizetheco-expressionofpcdfduet-ho1-pebb,pg-cpes,pacycduet-peba,pET30a(+)-sa-cpcb,thesyntheticSA-CpcB-PEB(fusionpigmentprotein)wasobtained.Next,weusedthepurchasedCEAandsa-rpeexperimentstotestthefeasibilityoftheapplicationofalginfluorescentprobetothe(BSA)fluorescenceimmunoassaysystem.Atthesametime,theself-madeproteinandsa-rpewereusedindifferentexperimentalconditions.Incubationtime,bufferandexperimentalmaterialastheway,theresearchofthedetectionsystemisrelativelyappropriateexperimentaloperation,theexperimentalresultsshowedthatthebestexperimentconditionis37℃,1.5hoursofincubationtime,onceafight,fightwithfluorescenceprobetojoin.Themethodadoptedinthisexperimenttosynthesizefusionpigmentproteinhasthecharacteristicsofconvenienceandlowcost,whichprovidesagoodtechnicalfoundationforfutureapplicationoffusionpigmentproteininfoodtesting,medicaltestingandenvironmentalpollutionmonitoring.
KEYWORDS:
Streptavidin;Phycobilitein;fluorescentprobe;Immunaossay
1.前言
1.1链霉亲和素(SA)
1.1.1链霉亲和素概念
链霉亲和素(streptavidin,以下简称SA),是与亲和素(avidin,以下简称AV)具有相似生物学特性的蛋白质,是streptomycesavidini(链霉亲和素菌)在培养过程中的一种分泌物,其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的AV相似,非特异性结合比AV低,与生物素结合常数是抗原反应的一万倍以上[1],于1963年由Stapley等专家分离链霉亲和素培养基得到[2]。
存在于鸡蛋清的AV等电点约为10.3左右,而SA的等电点比AV低较多,约为6.0,由于SA成分中无糖基,况且等电点低,所以在在免疫检测、杂交试验以及酶联免疫吸附测定中运用的优越性比较强,背景染色的透明度与检测的灵敏度较高[3]。
1.1.2链霉亲和素的性质
从分子量来看,SA是四聚体蛋白,分子量大小约为66KDa[4],一分子的SA可以与四分子的生物素结合,两者的亲和力极强。
在培养SA的过程中,Bayer发现[5],因为蛋白酶的作用,肽链N端与C端断链,分子量下降1/5,每条肽链仅剩约126个AA残基,其构成的四聚体蛋白就是核心SA,Bayer用试验证明,核心SA增强了生物素分子能力。
从活性与消光系数来看,SA的活性单位可以用1mg的蛋白结合生物素的ug数表示,从理论上来讲,核心SA的最高活性就是16.8u。
有实验证明,酪氨酸残基对蛋白的活性有一定的作用,一条肽链中含六个Tyr-33,硝基苯磺酰氟只要修饰三个,SA就会失去结合生物素的能力[6]。
而消光系数与蛋白中酪氨酸酶(Tyr)的含量有关,由于SA中的Tyr含量比AV高,所以SA的消光系数也比AV高,两者分别为3.4与1.57。
1.1.3SA的应用
经研究发现,SA可以与很多物质相结合,比如铁蛋白、各种酶类、荧光蛋白、荧光素以及化学发光物质。
其中酶标记、FITC标记以及胶体金标记是应用最广泛的标记[7]。
在日常试验中,比较常用的SA标记酶主要有:
辣根过氧化物酶(HRP)与碱性磷酸酶(AKP)。
丁杰等学者制备了链霉亲和素-胶体金探针,获得了一定的成效。
程振球实践于ELISA检测,一定程度上提高了稳定性与灵敏度。
来自噬菌体基因库的识别半抗原抗体免疫复合物,可以用来检测小分子的非竞争性。
MarianaCarlomagno通过实验,从多肽免疫复合物到核心链霉亲和素的C或N终端,建立无噬菌体的非竞争性分析除草剂广灭灵,再经过药物的重复筛选对条件进行了优化,使得纯蛋白达到了几十mg/L,上面的嵌合体的饱和浓度达到50%,并且检测的极限达到0.48ng/mL。
1.2藻胆蛋白
1.2.1藻胆蛋白的概念
1910年,Kylin首次发现藻胆蛋白(Phycobiliprotein),主要存在于蓝藻、隐藻、红藻与甲藻中,它是藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)、藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin,PEC)、藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin,APC)的总称。
从颜色类别看,藻胆蛋白主要分为藻蓝蛋白与藻红蛋白,前者的最大吸收光谱范围为610-665nm之间,后者的最大吸收光谱范围为490-570nm,它是一种捕光的色素蛋白,在叶绿素b和c出现之后,藻胆蛋白的捕光色素作用被取代,目前具有藻胆蛋白的藻仅有少数。
1.2.2藻胆蛋白的结构
藻胆蛋白的主要构成是脱辅基蛋白与色基,两者的半胱氨酸共价连接成硫醚键,一个脱辅基蛋白连结1-3个色基,色基的不同会使藻胆蛋白具有不一样的光谱性质。
藻胆蛋白单体主要是α与β亚基依靠静电形成,三个单体在中心轴周围形成三聚体,厚度约为30Å,外径约为110Å,2个三聚体可以形成六聚体藻胆蛋白。
藻胆色素是开链四吡咯结构,与半胱氨酸残基通过硫醚键共价联结。
共轭双键数目与位置的不同会导致藻胆色素吸收波长的不同,从而显示的颜色有所差异。
蓝藻包含的藻胆色素有四种,为藻红胆素、藻紫胆素、藻蓝胆素与藻尿胆素,它们是同分异构体,双键的位置差异导致光谱性质的不同。
Fairchild经过研究得出,大肠杆菌内的cpcE、cpcF所表达的蛋白在体外可以通过催化PCB和藻蓝蛋白α亚基联结,并形成新的产物。
Ducret研究发现,一个亚单位含1-4个分子发色基,一种藻胆蛋白最多可以连接两种色基。
藻胆蛋白内的超分子复合物-藻胆体,通常粘附在在真核细胞细胞基质和原核中的类囊体膜的表层,上面的复合物富含聚光天线和蛋白质来进行光合作用[10]。
1.2.3藻胆蛋白的应用
(1)保健品有研究表明藻胆蛋白可以提高淋巴细胞的活性,增强机体免疫的效能,提高抗病能力,对防治糖尿病也有一定的作用。
藻胆蛋白还可以延缓衰老、促进造血等功能[11]。
(2)荧光免疫检测目前,免疫分析法有酶联免疫法(ELISA)、荧光免疫法(FIA)与放射免疫法(RIA),以抗体抗原作为探针的免疫分析是一种高灵敏的荧光标记分析法。
藻胆蛋白作为荧光探针应用于荧光免疫检测系统不仅克服了合成过程产生有害物质、人工合成荧光素造高等不足,而且荧光量子产率高,色基多;在溶液状态下非常地稳定,容易存放。
(3)色素的应用藻胆蛋白可以作为化妆品与食品的添加剂,完全没有副作用,可以有效防止人工合成的色素对人体的影响。
1.3本论文主要研究的内容与意义
本论文将通过体内重组技术与大肠杆菌的表达系统构建链霉亲和素藻胆蛋白,即SA-CpcB-PEB。
然后,藻胆蛋白可以将其作为荧光探针应用于荧光免疫的检测。
通过免疫荧光标记的研究,可以试着应用于对抗体的疾病以及环境污染物的检测方面,进一步开发藻胆蛋白的应用效能。
高效液相质谱与色谱联用是检测环境残留污染物的常用手段,但仪器设备成本高,需要技术人员熟练地操作,不足以满足环境监测样品的便捷快速地检测。
随着分子生物学技术的崛起,为环境监测提供了较多快速、价廉、科学的监测技术与工具,如免疫测定技术、核酸探针检测与电泳分离纯化等。
目前制备藻胆蛋白荧光探针多采用化学交联技术,但是该技术的前期准备工作复杂,交联工程的副产物较多。
本论文采用分子生物学技术,降低反应成本,况且藻胆蛋白的半衰期长、灵敏度高,很适合作荧光探针。
2.核心SA的制备
论文的第一部份实验是以pUC57-sa的质粒为样板,用PCR扩增获得SA的编码基因。
然后,通过限制性内切酶切位点,与pETDuet连结,转化成大肠杆菌(BL21);最后,通过亲和层析纯化与大肠杆菌的异源表达,获得核心SA。
2.1素材与方法
2.1.1素材与试剂
(1)dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、Taqbuffer
(2)表达载体pETDuet-1
(3)大肠杆菌菌株BL21(DE3)
(4)限制性内切酶与酶切缓冲液
(5)LB培养基
(6)SDS-PAGE电泳缓冲液:
(7)亲和层析法提纯蛋白质缓冲液
(8)CaCl2储备液
2.1.2仪器
(1)电泳仪
(2)DNA扩增仪
(3)台式离心机
(4)蒸汽消毒器
(5)YX型电子恒温水浴锅
(6)台式离心机
(7)高速离心机
(8)隔水式电热恒温培养箱
(9)超声波细胞粉碎机
(10)高速离心机
2.1.3实验方法
(1)引物的合成,根据链霉亲和素目前已知的序列为样板合成2条引物(记为P1与P2),P1中,BamHⅠ的酶切位点设计在序列5’端;P2中,EcoRⅠ的酶切位点设计在序列3’端,实验中,P1与P2各自的酶切位点前引入三个保护碱基。
(2)链霉亲和素基因的PCR扩增,链霉亲和素基因片段由PCR扩增获得,约403bp。
材料为:
合成的P1与P2、pUC57-sa。
引物需用二次重蒸水溶解后,配成储备液,浓度为100μM。
扩增的条件为:
时间300秒,预变性温度94℃;时间60秒,变性温度94℃;时间60秒,退火温度为58℃;时间60秒,延伸温度72℃;上述三个环节循环三十次,再以延伸温度为72℃,延伸300秒。
扩增反应体系见下表2.1
表2.1扩增反应体系
单位:
μL
材料
用量
无菌二次重蒸水
15.7
Taq酶
0.8
dNTPs
1.0
P1
1.0
P2
1.0
Puc57-saDNA
1.0
Mg2+
2.0
Taqbuffer
2.5
总计
25.0
(3)表达质粒载体构建,由上面扩增取得的链霉亲和素基因片段经过琼脂糖凝胶的电泳分离与试剂盒的回收,在37℃的温度条件下,用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,酶切的体系具体见表2.2。
经过酶切后的产物通过电泳分离、回收之后,与pETDuet(克隆载体)在16℃温度下连结,时长为12小时,具体的连结体系见表2.3。
表2.2酶切体系
单位:
μL
材料
用量
BamHⅠ
0.6
EcoRⅠ
0.6
无菌二次重蒸水
8.8
PCR回收物
10.0
10×BufferY
5.0
总计
25.0
表2.3重组质粒连结反应体系
单位:
μL
材料
用量
酶切回收物sa基因片段
6.0
无菌二次重蒸水
3.0
酶切回收物pETDuet载体
2.0
T4DNAligase
1.0
T4DNAligasebuffer
1.5
总计
15.0
连结产物转化合成的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),并用含有LB固体培养基(内含70-100μg/mLAmp)平板筛选。
采用碱裂解法合成质粒,然后在温度为37℃的条件下,用coRⅠ与BamHⅠ双酶切质粒,时间为12小时。
把得到的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳检测,然后通过测序的方式进一步证实。
同时以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,将pETDuet-sa诱导表达,表达所得蛋白用SDS-PAGE的电泳来进行检测。
(1)采用Startbuffer(10ml)重悬LB培养基(500ml)来诱导表达的大肠杆菌细胞。
(2)采用在冰水浴的条件,超声破碎(200W功率)。
(3)在4℃温度下,将超声破碎物11000g离心,再取上清液。
(4)蛋白质纯化,采用亲和层析的方法可以用来纯化蛋白质。
T7启动子的下游有六个组氨酸密码子,可以用来构建获得的重组质粒再经过大肠杆菌的诱导表达得到蛋白N端均会具有六个连续的组氨酸,可以利用这个方法法进行纯化,具体的方法如下:
1、亲和层析柱的初始处理:
先后加入洗脱缓冲液(二倍柱)、二次重蒸水(三倍柱)、0.5MNi2+溶液(一倍柱)、二次重蒸水(三倍柱)、起始缓冲液(三倍柱)。
2、加入一定量经过离心处理的SA蛋白上清液。
3、加入起始缓冲液(三倍柱)洗柱,然后加入柱洗脱液1(三倍柱),用来洗脱杂蛋白。
4、依据蛋白量的多少倒入一定量的柱洗脱液2,用来收集目的蛋白。
然后纯化后的SA在4℃条件下搅拌透析,三小时换一次透析液,总共换四次,透析结束后收集SA的样品以备用。
2.1.4蛋白质的制样
(1)蛋白质制样
蛋白质的制样:
取透析好的蛋白质样品(20μL)置于离心管。
先后加入2×SDS上样缓冲液(25μL)、β-巯基乙醇(5μL)。
然后,煮沸15分钟,离心6分钟,取得上清液。
细胞制作样本:
诱导与表达完成后,取菌液离心,接着,加入蒸馏水重悬菌体。
离心1分钟,收集菌体。
然后,离心管中依次倒入1×SDS上样缓冲液、β-巯基乙醇。
混合摇匀后,煮沸15分钟,最后离心6分钟,取其上清液。
(2)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
采用分离胶(12%)与浓缩胶(5%)来进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3.融合蛋白SA-CpcB-PEB的构建及荧光免疫检测
为了将荧光探针应用于BSA(生物素-链霉亲和素系统)荧光免疫检测体系,我们首先构建SA-CpcB-PEB(融合蛋白),所以,需要融合蛋白既保留蛋白的荧光活性,也要保留蛋白SA与生物素融合的能力。
CpcB的半胱氨酸残基可以在藻胆蛋白裂合酶催化下和藻红胆素共价结合形成藻胆蛋白(有荧光特性)。
利用这个特性可以将融合蛋白与藻红胆素合成酶PebB、PebA和藻胆蛋白裂合酶体内重组,最终获得SA-CpcB-PEB(融合蛋白)。
3.1素材与方法
3.1.1素材与试剂
(1)氯霉素储备液:
(2)卡那霉素储备液
(3)链霉素储备液:
(4)醋酸锌溶液;
(5)CEA单克隆抗体、链霉亲和素标记的藻红蛋白、抗原CEA、兔CEA多克隆抗体;
(6)碳酸盐缓冲液(CBS);
(7)兔抗All5292血清、蛋白质All5292;
(8)生物素标记的羊抗兔抗体
(9)牛血清蛋白
3.1.2实验仪器
(1)多功能微孔板荧光检测仪;
(2)F-2500型荧光光谱仪;
(3)高速台式离心机、净化工作台、细胞粉碎机等
3.1.3实验方法
(1)蛋白表达和质粒转化
将pCDFDuet-ho1-pebB、pACYCDuet-pebA、pG-cpeS与pET30a(+)-sa-cpcB等4种质粒转化为新鲜制备BL21(大肠杆菌)感受态细胞。
然后,用含有Kan、Str、Amp、Chl的LB固体培养基筛选,选取处单克隆菌落,使得4种质粒在BL21(大肠杆菌)体内进行共表达,生成SA-CpcB-PEB。
把含有4种质粒的大肠杆菌培养于含有0.4%浓度甘油的LB培养基(250ml)中,在温度37℃的条件下,将250rpm培养到OD600nm加入终浓度的1mMIPTG。
然后在遮光的条件下,温度20℃、150rpm诱导表达。
结束后在温度4℃的条件下,9000g离心4分钟后收取细胞,在-20℃条件下保存,再进行重组蛋白质的超声破碎与纯化。
(2)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)与色素蛋白的锌电泳
Zn2+可以螯合蛋白质共价结合的四吡咯色素,在紫外光激发下螯合物会发出红色荧光,我们可以用色素蛋白锌电泳检查SA-CpcB-PEB中的蛋白质和四吡咯色素连结的方式正确与否。
1、将融合蛋白(SA-CpcB-PEB)放在一离心管,滴入三氯乙酸(浓度10%),在-20℃的条件下保存15分钟。
取出后再9000g离心6分钟,将上清遗弃,获得的沉淀物用丙酮洗。
然后,按顺序加入1×SDS上样缓冲液(45μL)、β-巯基乙醇(5μL)与尿素。
煮沸15分钟,用9000g离心6分钟,取得上清液部分。
2、浓缩胶(5%)和分离胶(12%)进行SDS-PAGE。
3、上一步的电泳结束后,把凝胶取出来放置在醋酸锌溶液(1.5mol/L)15分钟,然后用二次重蒸水冲洗干净,将其扫描保存。
4、把凝胶放置于考马斯亮蓝R250染色液2小时,然后用脱色液脱色12小时,再用二次重蒸水洗净,扫描保存。
3.2荧光免疫检测的操作步骤
(1)制备固相底物
用缓冲液(CBS)将底物稀释,在4℃的条件下,加入150μL/孔,吸附12小时。
结束后,去除余液,每个孔放PBST后清洗四次反应板。
然后,在37℃的条件下,将每个孔放满封闭液,开始孵育一小时,结束后去除孔内液体,清洗反应板。
(2)稀释
取稀释液,把兔抗All5292血清稀释大约一百倍,在37℃的条件下,放入150μL/孔,孵育1.5小时,然后倒去孔内残余液体,清洗反应板。
(3)加抗体
在37℃的条件下,每一个孔加入生物素(150μL)标记羊抗兔抗体,孵育1.5小时。
(4)测试荧光
在反应板中放150μL/孔,然后,利用微孔板荧光检测仪器检测,用波长544nm的光激发,滤光(中心波长590纳米、半波宽45nm),来检测背景的荧光。
(5)加入探针
在37℃的温度条件下,每一孔放入150μL荧光探针。
(6)检测
在反应板中放150μL/孔,然后,利用微孔板荧光检测仪器检测,用波长544nm的光激发(中心波长590纳米、半波宽45nm),荧光要用滤光片(中心波长590纳米、半波宽45纳米)滤光,最后检测荧光。
4.藻胆蛋白荧光探针在免疫检测体系的应用
4.1BSA荧光免疫检测体系检测抗原CEA步骤
将藻胆蛋白荧光探针应用于荧光免疫检测体系(BSA),用来检测抗原CEA。
用单克隆抗体包被反应板,得到的底物以CEA与特异结合,并阴性对照,然后,依次将兔抗CEA多克隆抗体、羊抗兔抗体加入到反应板,最后一步放入荧光探针,利用微孔板荧光检测仪来检测荧光。
(1)制备底物
在4℃的温度条件下,利用CBS稀释CEA单克隆抗体(浓度为0.01mg/mL),
每孔150μL,吸附一夜。
第二天甩去反应板残余液体,每个孔再加入缓冲液清洗,放置五分钟后再清理残余液体,操作四次。
然后,在37℃的温度条件下,反应板孔加入缓冲液,孵育一个小时,清理残余液体,清洗。
底物制备完成。
(2)加样
在37℃温度条件下,反应板每个孔加入单克隆抗体(150μL),设置阴性对照后,孵育一个半小时。
清理步骤如
(1)。
荧光免疫检测步骤如3.3.SA-RPE应用于荧光免疫检测体系检测抗原CEA,我们可以发现0.1纳克级别的抗原,试验具有一定的可行性。
4.2荧光免疫检测体系实验的优化
以的蛋白质All5292包被反应板,并设置阴性对照,底物以All5292兔抗血清结合,之后在反应板中放入用生物素标记过的羊抗兔抗体,并与All5292兔抗血清结合。
最后一步,放入荧光探针,用微孔板荧光检测仪检测到荧光。
我们可以用改变反应的条件,来做到优化检测体系。
4.2.137℃的温度下孵育时间对实验的影响
改变在37℃条件下,SA-RPE、用生物素标记过的羊抗兔抗体与兔抗血清的孵育时间,实验步骤如下:
用三组实验组,分别采用相同的实验材料,实验温度,但是设置不同的孵育时间,如1.5小时、1小时与0.5小时。
实验结果显示:
孵育时间对实验检测效果有明显的影响,孵育的时间越长,检测的效果越好,因为时间短的话,抗体与抗原之间反应可能不充分,会影响检测结果。
所以在37℃温度条件下孵育1.5小时可以保证检测效果。
4.2.2荧光探针与二抗缓冲液对检测实验的影响
改变实验材料的缓冲液,研究荧光探针与二抗缓冲液对检测实验的影响。
具体的实验方案如下;
将实验分成两组,一组荧光探针与二抗混合用稀释液稀释,另一组用透析液稀释加入。
实验结果显示,荧光探针与羊抗兔抗体混合在不同缓冲液的条件下,免疫测试效果也有不同。
经实验证明,荧光探针与二抗混合后用稀释液稀释加入实验效果更加明显。
4.2.3荧光探针、兔抗血清与二抗加入方式不同对实验影响
改变荧光探针(SA-RPE)、用生物素标记的羊抗兔抗体以及兔抗血清的加入方式,对荧光免疫检测实验的影响。
具体的实验方案如下:
第一组中三种实验素材一次加入;第二组兔抗血清先加入,二抗与荧光探针混合后透析液稀释加入;第三组三种实验素材混合后用稀释液稀释加入;第四组三种实验素材混合用透析液稀释加入。
实验结果显示,实验素材的加入方式不同对实验的效果有显著的影响。
依次加入的方式要明显好于其他方式,而荧光探针与二抗混合后加入的方式要优于三者混合的方式,三者混合的方式实验检测效果较差。
其中第一组与第二组的实验效果区别不明显,可以考虑先将荧光探针与用生物素标记过的羊抗兔抗体混合后加入,节约实验时间。
5.总
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