多靶点pCRISPR载体改良版单子叶植物用使用方法1026P副本.docx
- 文档编号:11617054
- 上传时间:2023-03-28
- 格式:DOCX
- 页数:25
- 大小:1.33MB
多靶点pCRISPR载体改良版单子叶植物用使用方法1026P副本.docx
《多靶点pCRISPR载体改良版单子叶植物用使用方法1026P副本.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《多靶点pCRISPR载体改良版单子叶植物用使用方法1026P副本.docx(25页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
多靶点pCRISPR载体改良版单子叶植物用使用方法1026P副本
CRISPR/Cas9-basedgenomeeditingtechnology
ACRISPR/Cas9vectorsystemformultiplextargetingofgenesitesinmonocotplants
亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室
华南农业大学生命科学学院
刘耀光课题组
(**************.cn)
1.CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图
2相关载体图谱
2.1CRISPR/gRNAvectors(单子叶植物用)(sgRNA:
singleguideRNA,简称gRNA):
注:
用载体骨架长片段隔开U3/U6启动子和gRNA区可避免未切断质粒被PCR扩增(短时延伸20秒)见后面)。
这些质粒在E.coliDH10B繁殖。
2.2CRISPR/Cas9双元载体(单子叶植物用)
pYLCRISPR/Cas9-MH,原命名pYLCRISPR/Cas9-MTmono(M=monocot;H=HPT,抗潮霉素基因)
pYLCRISPR/Cas9-MB(B=Bar,抗草苷膦基因)
本套载体系统的pCas9为本实验室设计合成的植物优化密码子基因。
双元载体骨架(LB—RB非T-DNA序列)为pCAMBIA-1300(ACCESSION:
AF234296)
与以前的载体相比,这2个载体改造了原来的融合型ccdB即LacZ/ccdB为ccdBs(shortenccdB,即删除了LacZ序列)及其相对方向反过来,其它部分不变。
注:
这些质粒保存在E.coliTOP10F’(LacIq)菌株繁殖,以使ccdB(大肠杆菌致死基因)能够被LacIq产生高水平阻碍蛋白抑制其表达。
3.基因组靶位点选择和双链接头设计
3.1靶位点选择
(1)在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A(用U3启动子)或G(用U6a~c启动子)的序列(A,G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基),优先选为靶序列
合成接头的形式(左:
连接U3启动子;右:
连接U6a启动子)
注意:
接头正向引物F和反向R命名命名是根据靶点在gRNA表达盒的连接方向决定,不是基因方向决定,否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向;另外注意设计引物(尤其反向引物)时的5’---3’方向。
(2)如果在NGG上游第20碱基不是A或G,可选20碱基为靶序列(参考KabinXieandYinongYang,2013,MolecularPlant)合成接头的形式
(连接U6a启动子)
也就是说,所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同的靶点就是19碱基(19+A/G=20),不相同的靶点就是20碱基。
(3)为了提高突变效率,可以对一个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因)。
建议在ORF5’区和功能结构域各设计1个靶点,使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失,或2个靶点之间的序列被敲除。
靶点序列GC%偏高可提高打靶效率,因此靶点最好含有11-14个C/G(包括U6转录起始点G)。
几个靶位点设计例:
左图:
切点在起始密码附近或尽量在ORF上游,或在特定的功能域(可能引起密码子缺失和移码)
右图:
切点在外显子末端或前端(可能引起移码,或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切)
(4)靶点特异性检查:
虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题(万一产生有负面作用的非特异打靶,把突变体与原受体亲本杂交(和回交)就可分离排除非特异打靶位点),但应该将候选靶序列+NGG(上下游加几十碱基)对目标基因组做Blast(选Somewhatsimilarsequences(blastn),避免在靶序列3’端+NGG与其它功能基因和基因组序列有相似性。
但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时,就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。
3.2靶位点接头引物设计例
4.多靶点pYLCRISPR/Cas9-MH(B)载体构建
4.1gRNA表达盒构建示意图
4.2靶点引物接头与gRNA表达盒的实际连接方式和扩增
为了提高接头连接效率,使用较高浓度(0.05-0.1μM)的靶点接头,实际上大部分产生线性单端连接,而环状(双端)连接较少。
另外,过度酶切,星活性,过度连接等可能产生破坏的平滑末端,有可能连接产生双接头产物或的空载产物(下图的产物IV和产物V)。
连接接头后,有3种方法扩增gRNA表达盒片段:
(1)直接用位置特异引物做一轮PCR扩增;
(2)做2轮巢式PCR,第一轮PCR用通用的U-F/gRNA-R做1个反应,第二轮用位置特异引物扩增;(3)做2轮巢式PCR,第一轮PCR做2个反应,分别用U-F/接头反向引物,和用接头正向引物/gRNA-R;第二轮为OverlappingPCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。
方法
(1)效果不那么稳定,且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。
方法
(2)的扩增效果好且稳定,但同样不能避免扩增产物IV和产物V。
方法(3)虽然第一轮PCR需要做2个反应,但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V,因此推荐使用方法(3)。
下图为方法(3)示意图。
在第一轮PCR加热过程中(73-75度),有缺口的引物(Tm值低于U3/6和gRNA序列)先解离,U3/6和gRNA序列3’端(未解离)立即延伸补平,产生接头引物互补结合位点。
4.3gRNA表达盒扩增引物
第一轮PCR扩增引物(所有gRNA表达盒共用):
U-F:
5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3;gRNA-R:
5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3
第二轮PCR扩增引物(使用策略IGoldenGateligation的位置特异gRNA表达盒专用):
(B1’,B2,B2’,B3,B3’等表示各连接点位置;ctcg,tcag等表示BsaI切点粘性末端的正链序列;相同颜色的BsaI切点粘性末端是可特异配对连接的互补末端)
靶点1(T1):
SpeI
(new)Uctcg-B1’:
TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3(U3/6上游引物)
gRctga-B2:
AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3(第二轮gRNA下游引物)
T2:
Uctga-B2’:
TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRaaga-B3:
AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T3:
Uaaga-B3’:
TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRgact-B4:
AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T4:
Ugact-B4’:
TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRggac-B5:
AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T5:
Uggac-B5’:
TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRtctg-B6:
AGCGTGggtctcGcagaGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T6:
Utctg-B6’:
TTCAGAggtctcTtctgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRaggt-B7:
AGCGTGggtctcGacctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T7:
Uaggt-B7’:
TTCAGAggtctcTaggtCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
gRcgct-B8:
AGCGTGggtctcGagcgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3
T8:
Ucgct-B8’:
TTCAGAggtctcTcgctCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3
(如果要多于8个靶点,通过设计不同的BsaI切点碱基,合成新引物对)
最后靶点(Lastsite)MluI
(new)gRcggt-BL:
AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3(与载体RB侧B-R互补)
当靶点数少于8个时,gRcggt-BL(BL)作为最后一个gRNA表达盒下游引物替代B2,B3,B4...,见以下引物使用方法)
4.4靶标gRNA表达盒排列和扩增引物使用方法
本系统目前使用水稻来源的4个smallnuclearRNA启动子(OsU3,OsU6a~c)。
当连接靶点多于4个时,为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性,使相同启动子间的距离尽量近(2个相邻的同向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2)。
因此建议U3、U6a~c启动子的使用和排列方式为:
1个靶点:
LacZ-U3
2个靶点:
LacZ-U3—U6a
3个靶点:
LacZ-U3—U6a—U6b
4个靶点:
LacZ-U3—U6a—U6c—U6b
5个靶点:
LacZ-U3—U3—U6a—U6c—U6b
6个靶点:
LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6c—U6b
7个靶点:
LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6b—U6c—U6b
8个靶点:
LacZ-U3—U3—U6a—U6a—U6b—U6b—U6c—U6c
靶点接头设计:
由于靶点接头的正向引物的5’端4个碱基是根据使用的不同启动子而不同的,因此要确定那个靶点使用那个启动子的基础上合成其正向引物。
特定位置gRNA表达盒引物使用方法(U#=U3,U6a~c):
1个靶点:
用引物对B1’/BL扩增相应的U#-T1-gRNA;
2个靶点:
用引物对B1’/B2,B2’/BL扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA;
3个靶点:
用引物对B1’/B2,B2’/B3,B3’/BL扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA;
4个靶点:
用引物对B1’/B2,B2’/B3,B3’/B4,B4’/BL扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA,U#-T4-gRNA
5个或以上靶点:
如此类推。
4.5靶标gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH(B)的连接方法
本载体系统可采用2种策略进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的一次连接组装:
策略I用GoldenGatecloning(ligation)方法(Engleretal.,2008;2009);策略II用Gibsonassembly方法(Gibson,etal.,2009,2010)。
GoldenGateligation是利用BsaI(typeIIsrestrictionenzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性,可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端(256-16=240种,减去的16种是回文结构;第6-7页的PCR扩增引物使用了16种)。
多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接(如下图,4个表达盒为例),而非连接点的末端之间不互补不能连接(相同末端分子间也不互补不能连接),因此连接反应是向着目标单方向进行,效率很高。
由于OsU3上游附有LacZ标记基因(198bp),可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆,达到绝对真阳性。
策略II见后面介绍。
操作流程图
注:
由Uctcg-B1’导入的载体唯一SpeI位点是特别留的一个“后门”,其用途是,在构建好一组目的靶点gRNA表达盒的载体的基础上,如果情况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒,可以用SpeI将载体切成线状,再用策略II(GibsonAssembly,见后面)将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。
5多靶点载体构建详细操作方法(策略I):
(1)菌种活化和质粒提取制备:
将pYLCRISPR/Cas9-MH(B)菌种(TOP10F’)和CRISPR/gRNAvectors菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素(25μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)平板培养基划出活化单菌落,取单菌落培养1ml种子液(不要将保存的菌种直接接种子液!
),再扩大培养用于提取质粒。
pYLCRISPR/Cas9-MH(B)载体较大(约16.5kb),拷贝数较低(pBR322复制子),用质粒小型柱提取纯化的回收率较低,因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒(如TIANGEN公司EndoFreeMaxiPlasmidKit)提取纯化(由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇,且体积大浓度低,最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积),或用普通碱裂解法提取(用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀)。
溶解在TE(约0.5μg/μl)保存。
取部分质粒稀释成约100ng/μl冷冻保存,作为步骤(10)使用。
由于BsaI是很容易失活的酶(有时新买的BsaI是失活的!
),在进行以下步骤之前,先检测BsaI活性:
配制10μlBsaI反应液,含有5UBsaI,~100ngpYLgRNA-U#(或其它有AmpR基因的质粒)。
37℃15min后电泳检查(也电泳50ng未切的相同质粒为对照)。
pYLgRNA-U#的BsaI图谱见第2页。
最好把BsaI分装成几管冷冻保存。
(2)(推荐使用以下4+5步骤边切边连方法,这个步骤只做参考,如果采用边切边连方法,不需要执行这个步骤)取约2-3ugpYLCRISPR/Cas9-MH(B)在50μl(30UBsaI)酶切30min,用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段(去除ccdB片段)(不要用太多酶或太长时间过度酶切)。
用0.5xTE洗回收胶30分钟,65℃3min熔解,在40℃加入Agarase(1U/100μl胶,NEB)处理30分钟后,分装成每管40-60ng(2-3μl)冷冻保存公用(一管做一次连接,以避免多次冻融)。
(3)靶点接头制备:
将接头引物TE溶解成100μM母液,各取1μl加入到98μl0.5xTE混合稀释到1μM。
约90℃30S,移至室温冷却完成退火。
(4)gRNA载体酶切:
取pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒各约1ug,在25μl反应用~10UBsaI(NEB公司)酶切20min(不要用太多酶或太长时间过度酶切),70℃5min失活酶。
冷冻保存公用。
(5)gRNA表达盒连接反应:
酶切过的pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒与各所对应接头连接反应:
1μl10xT4DNAligasebuffer;
0.5μl(~20ng)pYLgRNA-OsU#质粒;
0.5μl接头(最终浓度0.05μM)
加ddH2O至10μl
最后加约20~35U(0.05~0.1μl)T4DNAligase(Takara,其它公司的T4DNAligase单位定义不同,但每μl的酶活相当)
室温(20-28℃)连接约10-15min(过多DNAligase和过长时间连接会产生较多第6页所述产物IV&V!
)
(4+5)步骤4、5结合的简化(边切边连法)方法:
配制10μl1xBsaI酶切连接反应液:
在1xBsaI-内切酶Buffer中加入ATP至终浓度0.5~1.0mM,加入约20ngpYLgRNA-OsU#质粒(预先配好20ng/μl保存),0.5μl接头(最终浓度0.05μM),~5UBsaI,~35UT4DNAligase(此buffer对BsaI和ligase都有效)。
如果实验室没有ATP,在1x内切酶Buffer中加入0.2~0.3μl10xNEBT4DNAligasebuffer(10xNEBT4DNAligasebuffer中含有10mMATP,但10xTakaraT4DNAligasebuffer中含有1.0mMATP,因此优先用NEB的;或加1μl10xTakaraT4DNAligasebuffer)。
注意:
没有加内切酶buffer而单纯加T4DNAligasebuffer缺少KCl或NaCl,不适合BsaI酶切!
)。
用变温循环仪(或PCR仪)循环反应5循环:
37℃5min,20℃5min。
(6)扩增gRNA表达盒(虽然用第二轮PCR的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物,但用2轮PCR扩增可以更稳定地得到特异性目标产物且能避免空载产物扩增,见第6页)
(a)第一轮扩增(每个gRNA表达盒2个PCR反应,各15μl):
取1μl连接产物为模板,使用第6页引物U-F/接头反向引物(反应1),和接头正向引物/gRNA-R(反应2),各0.2μM,适量高保真PCR酶,最好使用KOD-Plus(TOYOBO),保真度最高且性价比高,或KODFX,或TakaraExTaq。
不要使用能在产物3’附加A碱基的Taq酶,此A碱基使产物在第二轮PCR中不与互补链配对而不能延伸补平)。
25-28循环:
95℃10s,60℃15s,68℃20s
(任意)取4μl电泳检查(反应2产物长度约140bp,最好用PAGE检查,或用2%琼脂糖胶)。
如果扩增产物较弱,也可以继续第二轮PCR。
(b)第二轮PCR:
按第6-7页所示,预先将位置特异引物对混合成10x工作液,每种1.5μM:
B1’+B2(PT1);B2’+B3(PT2);B3’+B4(PT3);B4’+B5(PT4);B5’+B6(PT5);B6’+B7(PT6);B7’+B8(PT7);B1’+BL(PT1L);B2’+BL(PT2L);B3’+BL(PT3L);B4’+BL(PT4L);B5’+BL(PT5L);B6’+BL(PT6L);B7’+BL(PT7L);B8’+BL(PT8L)。
引物组合
1个靶点:
PT1L;
2个靶点:
PT1,PT2L;
3个靶点:
PT1,PT2,PT3L;
4个靶点:
PT1,PT2,PT3,PT4L;
5个靶点:
PT1,PT2,PT3,PT4,PT5L;
6个靶点:
PT1,PT2,PT3,PT4,PT5,PT6L;
7个靶点:
PT1,PT2,PT3,PT4,PT5,PT6,PT7L;
8个靶点:
PT1,PT2,PT3,PT4,PT5,PT6,PT7,T8L
取第一轮PCR反应1,2产物1μl用H2O稀释10倍,各取1μl混合为模板。
各表达盒20-50μlPCR(1个靶点50μl;2-3个靶点各30μl;4个或以上靶点各20μl)。
加入1/10量每种引物组合工作液(最终浓度0.15μM)。
使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。
扩增15-20循环(实际情况调整):
95℃10s,58℃15s,68℃20s。
取2-3μl电泳检查产物长度是否符合,并估计样品的大致浓度。
注:
各种启动子gRNA表达盒的长度为(括号为BsaI切后):
U3-gRNA=767bp(728bp);U6a-gRNA=629bp(599bp);U6b-gRNA=515bp(485bp);U6c-gRNA=924bp(984bp)。
(7)根据各样品产物估算的量,把所有产物大致等量混合,酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化(除去Taq酶以防止下步骤补平BsaI酶切末端)。
(8)(如果采用步骤10方法II,不需要此步骤8和9)混合产物在50μlBsaI反应,用20UBsaI37℃酶切30min,73℃2min(使切出的13bp末端小片段变性,以减少连接竞争)。
用PCR产物纯化kit纯化,以去除切出的13/17碱基末端片段以防止连接竞争。
(9)方法I:
在切好分装(步骤2)的pYLCRISPR/Cas9-MH(B)(约60-80ng)管中,加入相当于每个靶点约10-15ng的步骤(8)酶切PCR产物(如1个靶点约10ng、2个靶点共20-30ng、3个共约40-50ng、4个共约60-70ng、更多靶点时每个片段的量适当增加(最多15ng/片段),不要加入过多的gRNA表达盒片段。
这样载体与每种插入片段摩尔比=1:
4-6),在10μl连接反应(加35U连接酶,不要过多连接酶),16℃(或最好用变温循环:
10℃5min,20℃5min;10-15循环)连接2-3h(不要过长时间连接)。
做3个以上靶点Cas9载体构建时,最好把BsaI切好的多个gRNA表达盒混合片段(先不加pYLCRISPR/Cas9-MH(B)片段)先在20℃连接约~3min将其连接成一个片段,再加入pYLCRISPR/Cas9-MH(B)片段(约60-80ng),再连接2-3个小时。
(10)方法II(边切边连法):
作为步骤8,9的简化替代操作,从步骤(7)取约20-70ng产物(参考步骤9中gRNA表达盒片段使用量),加入约60-80ng未切割的pYLCRISPR/Cas9-MH(B)质粒(预先稀释成约100ng/μl冷冻保存),在15μl反应(1xBsaI-内切酶Buffer)用10UBsaI37℃酶切~10min(不要过多BsaI和过长时间,否则载体会产生破坏平滑末端而自连)。
(不要失活BsaI!
)加入ATP至终浓度0.5~1.0mM。
如果实验室没有ATP,加~0.5μl10xNEBT4DNAligasebuffer(或1.5μl10xTakaraT4DNAligasebuffer),和35Uligase(不要过多连接酶)。
用变温循环酶切连接约10-15循环:
37℃2min;10℃3min,20℃5min;最后37℃2min。
此方法要点:
由于没有去除BsaI切出的13/17碱基小片段和ccdBs片段,它们会被竞争连接回原来的位置。
此变温边切边连反应能把连接回去的片段再次被BsaI切除,而连接好的目标产物序列由于不存在BsaI的识别位点不会被切断。
此方法简便效率高,阳性克隆率高,推荐优先使用。
(11)电激法转化:
将连接产物滴载在悬浮式透析膜MilliporeVSWP04700(0.025μm孔径)对1/5xTE透析15~30min(最好在4℃冷柜内)脱盐(或用乙醇沉淀,70%乙醇洗,风干溶在5μl去离子水),取1-1.5μl连接产物电激转化E.coliDH10B感受态细胞(虽然其它菌株也可以用,但DH10B更适合高效率电激转化大质粒。
电激转化感受体态细胞制备最好用SOB培养(不要用LB培养),以10pgpUC18质粒转化测试转化效率(小质粒用电激电压1800V/20μl感受态细胞/1μl电激杯),要求达到效率>109colonies/1μgpUC18(即电激10pg质粒,涂1/20转化细胞出500以上菌斑)。
>15
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 多靶点 pCRISPR 载体 改良 单子叶植物 使用方法 1026 副本