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教案1
细胞和组织工程
Cell&tissueengineering
第一部分
细胞工程概述及基础
第二部分
植物细胞工程
第三部分
动物细胞工程
第一篇细胞工程概述及基础
第一章绪论
一、概念
细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法,借助工程学的实验方法和技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的一门综合性学科。
广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术,狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。
细胞工程是运用细胞生物学知识和现代生物技术所设计的一种巧妙生物学方法,是定向改造生物的一种先进技术。
用这种技术可以对细胞进行操作,达到定向改造生物的目的。
人们根据科学设计改变细胞的遗传基础,通过无菌操作,大量培养所需细胞,诱导形成组织甚至发育为完整个体的技术。
迄今为止,人们已经从基因水平、细胞器水平以及细胞水平开展了多层次的大量工作,在细胞培养、细胞融合、细胞代谢物的生产和生物克隆等诸多领域取得一系列令人瞩目的成果,其中代表细胞水平的细胞工程研究也显示其巨大的应用前景。
二、细胞工程的发展历史
细胞工程发展历史悠久,随着现代生物学、工程学等相关学科的飞速发展,其内涵和外延得到不断的扩展。
植物:
•1809年由德国植物学家G.Haberlandt首创了植物细胞培养
•1838,哈泊兰德Haberlandt预言了植物细胞的全能性;
•1934,荷兰温特发现生长素;
•1939年由Gautheret,Nobercour和White成功的用烟草、萝卜和杨树细胞培养出组织;
•二十世纪50年代开始植物细胞大规模培养
•1960,英国诺丁汗大学科金教授使用酶解方法,从番茄幼苗根部制备得到大量原生质体;
•1972,美国卡尔森等用NaNO3为融合诱导剂,将来自不同种的烟草原生质体进行融合,获得世界上第一个体细胞杂种植株;
动物:
•1907年由美国生物学家Harrison用淋巴液培养青蛙胚神经细胞数周
•1951年Earle等开发出促进动物细胞体外增殖的培养基
•1958年日本的冈田开发出动物细胞融和技术
•1977,英国胚胎工程技术,首例试管婴儿;
•1997,多莉克隆羊;
•2001,首例克隆猪…
三、主要研究内容
细胞工程涉及的领域相当广泛,根据研究对象不同,可以将细胞工程分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程三大类。
1.动物细胞工程的技术范围包括:
(1)细胞培养技术
(2)组织和器官培养技术
(3)细胞融合技术
(4)胚胎工程技术:
核移植、胚胎分割等
(5)克隆技术:
单细胞系克隆、器官克隆和个体克隆
(6)干细胞工程
2.植物细胞工程包括:
(1)植物组织、器官培养技术
(2)细胞培养技术
(3)原生质体融合与培养
(4)亚细胞水平的操作技术
四、细胞工程的研究对象
动物、植物、微生物
就某个物种的研究水平而言,包括
基因、染色体、细胞核、原生质体、细胞、受精卵、胚胎、组织、器官等
五、细胞工程重要应用及与其他学科的关系:
应用:
(一)改善农业生产技术
1.优质植物快速培育与繁殖
可通过植物胚胎(成熟胚或未成熟胚)
或器官(根尖、茎尖、叶原基、花药等)的离体培养,再生成新植株(试管苗)。
这种方法能快速、大量繁殖一些有价值的苗木、花卉、药材和濒危植物等。
2.动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种
体外受精,胚胎体外发育--“试管动物”
3.新型动植物品种的培育
多倍体、单倍体育种
细胞融合
转基因动植物
(二)生物医药开发
1.利用动植物细胞培养生产活性产物、药品;
动植物细胞培养技术是21世纪细胞工程发展的重点
动物细胞和植物细胞都可以如同微生物细胞那样,在人工控制条件的生物反应器中培养,以获得各种所需的产物。
(1)植物细胞培养
基于植物细胞全能性,使用细胞培养技术在适当的生长条件下(一定的光照、温度、pH值等),使细胞、组织能够生长和不断增殖,达到人工优良育种和大量制备次生代谢产物的目的。
色素、香精、药物(生物碱、类黄酮、甾体等)、酶等
提问:
与植物栽培相比有何优势?
(2)动物细胞培养
已经启用了300升和1000升的培养罐,分别用于生产单克隆抗体和灰色脊髓炎等疫苗的生产。
疫苗、生长因子、单克隆抗体、酶、多肽等
目前,由动物细胞生产的产品有:
口蹄疫疫苗(FMD),小儿麻痹疫苗(polio),乙肝疫苗(HBsAg),干扰素(IFN),白介素(IL),B细胞生长因子(BCGF),T细胞替代因子(TRF),巨嗜细胞替代因子(MAF),神经生长因子(NGF),成纤维细胞生长因子(FGF),表皮生长因子(EGF),促红细胞生成素(EPO),促黄体生成素(LH),促滤泡素(FSH)等
此领域已成为世界各国新型医药产业的发展重点
2.转基因动植物的生物反应器工程
一个转基因动植物就是一座天然基因药物制造厂。
(1)动物:
动物乳腺生物反应器
转基因牛-乳铁蛋白
转基因羊-α1-抗胰蛋白酶(治疗肺气肿)
动物血液生物反应器
转基因猪-人血清白蛋白
(2)植物:
转基因烟草-脑菲肽(镇静)、核糖体抑
制蛋白(HIV)、疫苗等
转基因马铃薯-疫苗、人血清白蛋白
(三)医学器官修复或者移植
组织工程利用人体残余器官的少量正常细胞进行体外繁殖,可获得患者所需的、具有相同功能的器官。
新兴的组织工程,是用少量组织细胞通过体外培养扩增,构建新的组织和器官,最终在人体实现无损伤修复和真正意义上的功能重建-曹谊林
举例:
兔子耳朵上复制出人耳;干细胞工程
(四)保护自然资源,维护生态平衡
珍稀动植物资源的保护
在能源、环保等领域的应用
(五)基础研究上的应用
遗传学、发育生物学、动植物生理学等领域的理论研究
提供了一种新的实验体系
细胞工程与其它相关学科的关系
1.细胞工程学科的建立和发展依赖于相关学科理论的支持
细胞生物学、分子生物学、遗传学、植物学、动物学、生产工艺学、物理……
2.为生物学研究提供新的实验体系
细胞培养技术-进行单细胞生命活动研究
细胞融合-定向改造生物遗传性状
离体培养-人工模拟条件下进行
3.细胞工程必须与其它生物技术及相关学科紧密结合才能更好地发挥作用
相互促进、共同发展
(1)需要其他相关学科和技术的协作和补充
(2)是其他生物技术的一个重要环节(如基因工程的下游技术属于细胞工程的范畴)
课内讨论:
通过这门课的学习,你最想了解些什么?
第二章细胞工程基础
第一节细胞生物学基础celltheory
一、细胞的发现
由于人类肉眼观察能力的限制,大多数早期的生物学家研究主要集中在研究工具的研制方面,以便使科学家可以观测到更微小的东西,细胞理论正是随着显微镜的出现而形成的。
1.17世纪初,CalileoGalilei通过两个玻璃透镜形成一个圆柱体工具,观察到了昆虫的研究,并绘制几何图。
2.1665年,RobertHooke应用自己的简易显微镜观察软木片时,发现蜂窝状的小室,实际上是软木死细胞,它将小室命名为Cellulac(拉丁语),这就是原始生物学术语细胞-cell。
意义:
RobertHooke的发现为以后的细胞学说打下了基础
3.1674年和1683年,AntonyVanLeeuwenhook用自制的所谓高倍显微镜发现了肉眼难见的细菌,之后几乎近两个世纪没有人看到比细菌小的细胞。
4.1831年,罗伯特•布朗从兰科植物的叶片表皮细胞中发现了细胞核;
5.1835年,在低等动物根足和多孔虫的细胞中发现了细胞内含物细胞质;
二、细胞学说及其发展
1838年,Scheiden和Sehwann在总结前人经验的基础上,根据自己的观察结果,提出了为世人瞩目的细胞学说:
(1)所有生物都是由一个或多个细胞组成。
(2)细胞是生物形态结构和功能的基本单位
1885年,RudolfVirchow在研究细胞的繁殖现象之后提出:
(3)一切细胞只能来自原来的细胞,机体一切病理基于细胞的损伤。
他的观点与施莱登、施旺的观点共同组成了细胞学说的三点论。
细胞学说的发展:
(1)细胞是生命的基本结构单位,所有生物都是由细胞组成的;
(2)细胞是生命活动的功能单位,一切代谢活动均以细胞为基础;
(3)细胞是生殖和遗传的基础与桥梁;具有相同的遗传语言;
(4)细胞是生物体生长发育的基础;
(5)细胞是生命起源的归宿,是生物进化的起点;
(6)没有细胞就没有完整的生命(病毒的生命活动离不开细胞)
三、细胞特性
细胞——生命结构和功能的基本单位,是生命活动的基本单元。
Cell——structureandfunctionunitoflife
细胞是生物体的基本结构单位和功能单位,单细胞生物,一个细胞就是一个个体,而多细胞生物则由许多细胞成一个个体。
我们所看到的生物体都是由多细胞所组成。
在多细胞生物体中,由形态结构相似的细胞再组成组织,执行着生物体中的部分功能。
(一)细胞大小与形态
各类细胞大小的比较
细胞类型
细胞大小(直径,μm)
支原体细胞
0.1-0.3
细菌细胞
1-2
动物细胞
10-30
植物细胞
10-100
原生动物细胞
数百至数千
1.大的卵细胞,胚胎发育需大量营养
2.长的肌细胞,需要拉动不同的身体部位。
3.长的神经细胞,需要传递神经信号到身体不同部位
4.大多数细胞比较小(10-100μm),如人的血红细胞10μm,可以穿过毛细血管。
5.Surfacetovolumeratio
(1)细胞随直径增大,体积增大比表面积增大快
(2)大的细胞相对于它的体积来说,比小的细胞的表面积小得多
(3)细胞表面积和体积比限制了细胞的大小
(4)细胞的大小是由细胞活动的效率决定的:
快速吸收营养,快速排出代谢废物,这是细胞长期进化的结果。
结论:
细胞形态由功能决定。
(二)细胞生长周期及调控
1.细胞周期定义:
由一个细胞增殖分裂为两个细胞的过程,在这个过程中染色体复制一次,然后随着细胞分裂分离到两个子细胞中,这种周期分为G1;S;G2;M四个时期,G1;S;G2为细胞周期,M为分裂期
2.细胞周期及各阶段特点:
(1)G1期:
有丝分裂后期、DNA复制前的时期
与DNA合成启动相关,开始合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA、碳水化合物、脂类等,同时染色质去凝集。
特点:
染色体加倍、染色体为解凝缩状、准备DNA复制
(2)S期:
指DNA复制的时期
DNA复制,保证分裂后两个子细胞染色体和DAN含量保持稳定
特点:
DNA复制与组蛋白合成同步,组成核小体串珠结构。
S期DNA合成不同步
(3)G2期:
指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间
DNA复制完成,在G2期合成一定数量的蛋白质和RNA分子
(4)M期:
细胞分裂开始到结束
M期即细胞分裂期,真核细胞的细胞分裂主l要包括两种方式,即有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)。
遗传物质和细胞内其l他物质分配给子细胞。
特点:
a.染色体超螺旋化,形成两条染色体单体
b.一个细胞分裂为两个细胞
c.可以分为前期、中期、后期和末期
3.细胞周期关键点(检测点)
细胞分裂周期主要受Cyclin-dependentproteinkinase(Cdk)复合体的控制该复合体在S期和G期之间合成,在DNA合成后其活性降低,Cdk复合体影响染色体凝缩,核膜解体,纺锤体(spindle)形成,凝缩染色体在赤道面的排列等。
Cdk复合体还通过活化后期促进复合体(anaphase-promotingcomplex:
APC)以促进细胞分裂。
(1)G1→S:
存在于G1之内,控制细胞进行复制的关键点
DNA是否损伤?
细胞外环境是否适宜?
细胞体积是否足够大?
在酵母中称start点,在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)。
(2)S期检验点:
DNA复制是否完成?
(3)G2→M:
存在于G2之内,控制细胞进行分裂的关键点
DNA是否损伤?
细胞体积是否足够大?
(4)中-后期检验点:
纺锤体组装检验点。
4.G0细胞:
位于细胞周期中G1后段,而且存在G1G0的转化过程,G0细胞处于静止状态,不进行分离,在G1S检测点,细胞要做出是否进入下一次分裂或处于静止状态G0的决策。
如:
部分肝脏细胞,一定时期的乳腺细胞
另外,有一部分细胞属于终端分化细胞,如神经细胞、肌肉细胞等。
总之,分裂细胞+终端分化细胞+G0细胞=机体和组织细胞活动多样性
5.周期蛋白
随细胞的周期性的运转而出现和消失的特异蛋白,含类似于周期蛋白框的一致性共有序列的一组蛋白,叫周期蛋白
周期蛋白框是一段约100个氨基酸的区段,有5个螺旋结构,它是介导周期蛋白与其依赖的周期蛋白激酶催化亚基cdc2结合的关键部位,两者结合以后,依赖于周期蛋白激酶上的可被ATP磷酸化的部位,如Thr14,Tyr15,磷酸化后则调节细胞的周期性活动。
周期蛋白可以分为A、B、C、D、E、F、G、H几种,依赖于周期蛋白激酶:
cdc2,cdk2-7。
在各个细胞周期阶段,涉及到的周期蛋白和依赖于周期蛋白激酶均不相同:
M期:
cdc2和周期蛋白B
G期:
cdk2,cdk4,cdk5,cdk6,周期蛋白E、D
S期:
cdk2,周期蛋白A
G2期:
cdc2,周期蛋白A、B
6.培养细胞周期同步化
培养中的细胞不可能会处于同一时期之中,采用同步化的培养技术可以获得一致时期的同步化细胞,下面介绍同步化技术:
(1)正常培养细胞2-3天,达到50-70%的覆盖率
(2)加入胸苷,终浓度2mmol/L,继续培养15-18天,可以使细胞停在G1/S边界上。
(3)去掉培养液,洗1-2次,用新鲜的培养液培养8h。
(4)加入胸/,终浓度为2mmol/L,继续培养18h。
(5)去掉培养液,洗1-2次,收集的细胞为G1期细胞。
(6)在诱导的G1细胞中,加入新培养基,继续培养3h,收集细胞为S期细胞。
(7)在诱导的G1细胞中,加入新培养基,继续培养8h,收集细胞为G2起细胞。
(8)在诱导的G1细胞中,加入nocodazole,以阻止染色体,终浓度为600μg/mL,加新培养基继续培养12-14h,收集的细胞为M期细胞。
(9)G0期细胞的诱导:
90%覆盖时,用0.5%小牛血清培养基饥饿培养3天。
三、细胞的分化和全能性
多细胞生物体是由各种各样形态和功能都不同的细胞群所组成。
高等动、植物由受精卵细胞开始的胚胎发生过程随着细胞分裂次数的增加使得早期胚胎的细胞数量也增加许多。
其中有些细胞在形态、结构和功能上逐渐发生了差异,这种细胞之间差异的发生过程就是细胞分化。
个体发育的过程就是细胞分化的过程,个体的各种器官和组织都是通过细胞分化形成的。
(一)细胞分化(Differentiation):
是指细胞形成不同结构,引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
脱分化(dediffrentiation):
由组织或器官获得的细胞经过人工培养后使之丧失掉原有的分化功能,变回到母细胞状态
再分化(rediffrentiation):
将脱分化的母细胞再培养成分化细胞,并且形成组织或器官以及生物体
(二)细胞的全能性:
概念:
某些细胞能够分化出各种细胞、组织,形成一个完整的个体,我们把这种细胞的分化潜能称为细胞的全能性。
20世纪初由K.E.Goebel提出细胞全能性
1958年Steward胡萝卜根的韧皮部组织形成完整的植株。
1964年GuhaMaheshwari利用毛叶蔓陀罗的花药培育出单倍体植株
1969年Nitch将烟草的单个单倍体孢子培养成了完整的单倍体植株。
1970年Steward用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成可育的植株。
有哪些细胞具有全能性?
a.受精卵
b.植物的枝、叶、根都有可能长成一株完整的植株
细胞培养的结果证明单个分化的植物细胞可以培养成一个完整的植株
成熟动物细胞显然不具备全能性
第二节普通生物学基础
一、组织和器官
组织:
组织:
在个体发育中,具有相同来源的(即由同一个或同一群分生细胞生长、分化而来的)同一类型、或不同类型的细胞群组成的结构和功能单位称为组织(tissue)。
即形态结构相似,生理功能相同的一组细胞(细胞群)。
如皮肤组织、神经组织等
器官:
一些组织结合在一起构成器官,以执行特定的功能,如:
心脏、肝脏等
二、生殖、发育
1.无性生殖
不涉及性别、配子和受精过程的生殖
裂殖、出芽生殖、孢子生殖、再生作用(植物、动物)
2.有性生殖
高等植物:
完整周期
配子结合:
胚珠中的卵细胞(雌配子)与花药中的
花粉(雄配子)结合——
受精卵:
具有全部遗传信息和分化潜能——
胚:
从胚乳中吸收营养,分化成各种组织和器官——
完整植株——
释放雌、雄配子
下一个循环
高等动物;
第三节新工具和新技术的出现促进了细胞工程的发展
一、显微镜技术Microscopy
从Roberthooke发明显微镜到现在已340年了,随着显微镜技术的不断改进和完善,不仅出现了光学显微镜,而且出现了放大倍数更大的显微镜
(一)光学显微镜Lightmicroscopy
1.典型的动物细胞直径在10-20μm,比人眼最小颗粒还小5-10倍,只有借助于显微镜才可以观察到细胞内部结构,故常用光学显微镜来观察细胞结构。
2.分辨率(R-resolvingpower):
显微镜或人眼在25cm明视距离处,能清楚分辨被检物细微结构最小间距的能力
人眼:
R=100μm
光学显微镜:
R=0.2μm
3.显微结构:
常将光镜下所见的物体结构称为显微结构。
一定波长的射线不能应用于观察比它本身波长短得多的结构,这是一切显微镜的一个基本限度。
4.光衍射效应:
光线并不是按直线前进,光波沿各种有细微不同的路线振动而行,通过显微镜观察一个点,像一个粘盘,相邻两点互相重叠而不分开,可见光两点间能清楚地分辨的最小间距=0.2μm,称为分辨极限,这就是光镜的分辨力
5.细胞不同组分可以被选择性染色
多数细胞总重量70%是水,对可见光透明的,未经处理的细胞在光镜下不可被清楚地看见,必须用染料进行染色处理。
a.苏木精:
对负电荷分子有亲和性,常用于核酸的染色
b.伊红:
酸性染料,可以对细胞质染色
c.苏丹染料︰乙醇饱和液:
可以对脂肪染色,染色机制尚不清楚
6.结合细胞化学方法研究细胞化学组成和细胞的酶活性或相关基因
细胞特异性染色剂及酶的细胞化学方法:
了解细胞中大致的化学组成和某些酶或活性基因,例如,孚尔根反应可特异性检测细胞中的DNA。
7.荧光显微镜技术FluorescenceMicroscope
利用强烈的经过滤光镜过滤的激发光线,激发标本产生荧光
特点:
染色简便,标本呈彩色图案、明亮,灵敏度比较高
8.相差显微技术
细胞各结构的密度不同,通过致密部分的光线速度小,与通过邻近部分的光线产生相位偏差或光程差,这种差异是人眼不可分辨出来的,显微镜利用光的衍射和干涉特性,把经过不同区域的光线的光位移差转化为振幅差,使细胞各结构之间呈清晰对比。
特点:
可以观察活细胞,可以在镜下连续拍摄
9.显微照相技术
细胞本身运动速度比较慢,人眼难以在短时间内看出,该技术可以达到时间缩放,在相差显微镜下,每隔一定时间拍一次,当影片或录像以正常的速度播放时,所拍的情节大大加快,故可以准确记录细胞和细胞器运动的过程和速度。
特点:
适用于活细胞、细胞器的运动规律研究。
如:
细胞凋亡过程
共聚焦激光扫描显微镜Confocal
该设备是80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新技术,是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器,它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外或激光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,观察细胞的形态变化或生理功能的改变,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。
奥林帕斯显微操作系统(ProgrammableMicroinjector)IM300
对于细胞的显微注射,IM300可以将任何类型的分子或者分子结合物注射到细胞的细胞质和细胞核中去。
例如,RNA,DNA,蛋白质,抗体,标记染料,人工合成的分子,多肽,以及所有的细胞器都可被注射。
细胞的吸持,转移甚至是染色体的分离都可以通过它来实现。
IM300可以把皮升级到较大体积的液体注射到目标中。
对于精细胞的的注射(IntraCytoplasmicSpermInjectionICSI),IM300可以精确的控制和转送精细胞。
通过连续和十分细微的吮吸、排除压力的调节和电脑化的时间调节,可以实现对单个精细胞进行方便和精细的操作。
主要用途和应用领或:
卵细胞注射:
用于转基因动物模型的研究
胚胎注射:
用于转基因动物模型研究,胚胎干细胞研究
一般细胞注射:
核酸,蛋白质,多肽,药物功能研究
卵母细胞单精子显微注射(ICSI)技术:
用于男性不育,人式受精技术
细胞吸持:
用于细胞计数,细胞分离
(二)电子显微镜技术
电子的波长比光短,因而用电子代替光可以大大提高显微镜的分辨率,电子运动快,波长比较小,如10万伏加速的电子,波长为4×10-3nm,在理论上,可以用此电子照相,显微镜分辨率为2××10-3μm,分辨力高100倍。
超微结构,即亚显微结构,指电镜下可以观察到的结构,如细胞器等细微结构。
1.透射电子显微镜TEM使用电磁透镜,由精密线圈产生磁场,使用的照明工具是电子束,而光镜使用的是玻璃透镜,与可见光、透射电子显微镜,需要超薄切片(50-100nm),将一个细胞分成100-200块。
特点:
(1)透射观察,可观察到二维结构
(2)可以观察到细胞内部的超微结构、局部结构
(3)不可以用于观察活细胞(需超薄切片)
2.扫描电子显微镜SEM:
电子束经光镜聚集成极细的电子探针,在样品表面逐线扫描样品,被电子激发产生二次电子,经收集、转换,放在荧光屏上成像。
样品发出电子多的地方,在屏上相应位置就变亮,反之则暗。
特点:
(1)用于观察细胞及内部的表面结构
(2)立体感强,三维结构
(3)分辨力(2nm)不及透射电镜(0.1nm)高,用于单个细胞或细小的生物样品。
3.共焦激光扫描显微镜CLSM
特点:
二维或三维图象分析处理,借助其它技术构成多功能,进行全自动、高效快速的微量定量测量。
CLSM可以对细胞进行三维结构图像分析,细胞内各种荧光标记物的微量分析,细胞内Ca2+值等动态分析测定,细胞受体移动。
二、分子生物学技术
转基因技术
基因工程的两个关键基础:
所有生物的DNA的基本结构都是一致的,因此两种生命形态的基因可以融合为一体。
密码子与氨基酸之间的关系是同样的,即:
遗传密码是通用的
第三章细胞工程研究的基本设备和无菌操作
一、基本实验室设备
从事细胞工程操作与其他研究—样,需要建立一系列实验室,包括
准备室(洗涤室)、配制室、灭菌室(接种室)及培养室等。
每种实验室均需有专用设备:
(1)准备室设备:
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品规(放置消毒过的物品)、包装台。
(2)配液室的设备:
扭力天平和电子天平(称量药品
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