核酸提取常见试剂的作用原理.docx
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核酸提取常见试剂的作用原理
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核酸提取常见试剂的作用原理
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异硫氰酸胍
强用力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。
胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂,在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。
含有强力的阴离子和阳离子基团,它们可以形成较强的氢键。
在还原剂存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如SDS存在的情况下,可以破坏疏水作用。
盐酸胍、尿素
盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂,它并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。
4-8M可断裂氢键,有两种可能机制:
1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合,形成变性蛋白-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N-D反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性;2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂,使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。
高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性
十二烷基肌氨酸钠
使蛋白质解体变性
巯基试剂
1防止蛋白质或酶等(如辅酶A)分子中SH基团氧化成二硫键,2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。
DTT,DDTE、巯基乙醇应用最广,谷胱甘肽也常应用,由于他是生物体内的还原剂,同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。
DNA提取中,常使用巯基乙醇,维持缓冲液的还原环境,防止多酚类氧化,由于具有一定的毒性,浓度不应高于2%。
巯基乙醇
HYPERLINK"\t"_blank"β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键(肽和蛋白质分子中的HYPERLINK"\t"_blank"半胱氨酸残基中的键)。
1还原蛋白质二硫键,使Rna酶变性
2抑制酚类氧化,若氧化,核酸会变成灰黑色,苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联
3保护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要
巯基乙醇还原二硫键,使RNA酶失活
化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键,不能使蛋白质彻底变性
加上还原剂巯基乙醇或DTT,能还原二硫键,使RNA彻底变性
DTT二硫苏糖醇
刺激性气味要小很多,毒性也比巯基乙醇低很多。
而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时,两者效果相近,但DTT价格略高一些。
由于容易被空气HYPERLINK"\t"_blank"氧化,因此DTT的稳定性较差;但冷冻保存或在HYPERLINK"\t"_blank"惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。
由于质子化的硫的亲核性较低,随着pH值的降低,DTT的有效还原性也随之降低;DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。
抑制Rnase活性
TCEP三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐
半胱氨酸
Trizol
苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、HYPERLINK"\t"_blank"β-巯基乙醇等。
TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地HYPERLINK"\t"_blank"变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、HYPERLINK"\t"_blank"β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。
0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。
异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使HYPERLINK"\t"_blank"蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。
HYPERLINK"\t"_blank"β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
液氮
组织破碎,裂解细胞
SDS
十二烷基硫酸钠
阴离子去垢剂,高温(55-65℃)裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,形成SDS/蛋白质/多糖复合物,释放核酸,提高盐(KAc或NaAc)浓度并降低温度(冰浴),使SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的DNA
操作简单,温和,可提取到高分子量的DNA,但产物多糖类杂质较多
阳离子强表面活性剂,通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用
可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离
溶解膜类蛋白
SDS能裂解细胞。
使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合,阴离子去污剂能够破坏这种价键,使染色体离析,蛋白变性,释放核酸。
(1)SDS是一种HYPERLINK"\t"_blank"阴离子表面活性剂,能使蛋白质的HYPERLINK"\t"_blank"氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质的疏水部位;
(2)SDS可引起蛋白质构象改变
(3)SDS是一种良好的解离剂,可使蛋白质溶解,变性
(4)形成SDS-蛋白质复合物,并使复合物带负电
质粒方面:
在1%的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl,你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl,你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是HYPERLINK"\t"_blank"十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)遇到HYPERLINK"\t"_blank"钾离子后变成了HYPERLINK"\t"_blank"十二烷基HYPERLINK"\t"_blank"硫酸钾(potassiumdodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的,因此发生了沉淀。
如此看来,溶液III加入后的沉淀实际上是HYPERLINK"\t"_blank"钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的是大肠杆菌的HYPERLINK"\t"_blank"基因组DNA也一起被HYPERLINK"\t"_blank"共沉淀了。
基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100kb大小的片断,就没有办法再被PDSHYPERLINK"\t"_blank"共沉淀了
CTAB
CTAB:
十六烷基三甲基溴乙胺,低温时易沉淀
阳离子去污剂
一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物,低盐浓度下可沉淀的表面活性剂
是一种HYPERLINK"\t"_blank"阳离子HYPERLINK"\t"_blank"去污剂,低离子强度(0.1-0.5MNaCl),沉淀核酸与酸性多聚糖,而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液中。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入HYPERLINK"\t"_blank"乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
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