微生物系列实验报告.docx

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微生物系列实验报告

微生物工程综合性大实验

实验内容

实验一谷氨酸发酵系列实验

实验二青霉素发酵系列实验

实验三啤酒发酵系列实验

实验四酸奶发酵系列实验

实验一谷氨酸的发酵系列实验

（一）谷氨酸菌种的制备

一、实验目的

了解发酵工业菌种制备工艺和质量的操纵，为发酵实验预备菌种。

二、实验原理

菌种制备的主若是尽可能培育出高活性能知足大规模发酵需要的纯种，要紧纺纱方式为：

分离纯化和扩大培育。

一样2个月分离纯化一次，分两步进行。

①平板稀释法分离出单细胞菌落；②挑取假设干单细胞菌落接种于试管斜面培育基，然后把这些菌株别离用三角瓶进行药瓶发酵实验，比较各菌株产酸的高低，选择产酸高的菌株供生产用。

三、实验材料、仪器与试剂

材料谷氨酸棒杆菌

仪器试管；三角瓶；烧杯；量筒；玻棒；PH试纸（～）；天平；立式高压蒸汽灭菌锅；培育箱；显微镜等

试剂无水乙醇；牛肉膏；葡萄糖；蛋白胨；可溶性淀粉；胰蛋白胨；酵母提取物；NaCl;5mol/LNaOH;1mol/LHCl;KNO3;K2HPO4﹒H2O;MgSO4·7H2O;

MnSO4·H2O。

四、实验步骤

（一）培育基的制备

1）平板培育基

葡萄糖%；蛋白胨1%；牛肉膏1%；%；琼脂2%（pH=）

配置50ml培育基，灭菌后倒2个平板。

2）一级种子培育基

蛋白胨1%；酵母浸出粉%；NaCI1%；（pH=）

用三角瓶配置100ml，高压灭菌20min。

3）二级种子培育基

葡萄糖%；尿素%；3水磷酸氢二钾%；7水硫酸镁%；7水硫酸哑铁%；1水硫酸锰%（pH=）

用三角瓶配置100ml，高压灭菌20min。

（二）菌种的制备

1）用平板稀释法在平板培育基进行画线，分离出单细胞菌落；

2）用接种环挑取假设干个单细胞菌落接到一级种子培育基，置于控温摇床200r/min，振荡培育12h，温度为32℃。

3）取10ml一级种子培育基接到二级种子培育基中，置于控温摇床200r/min，振荡培育12h，温度为33-34℃。

附：

二级种子质量要求

1）pH在左右；

2）残糖量在%以下，其他同一级种子；

3）OD值净增加>。

（二）谷氨酸发酵及操纵

一、实验目的

了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全进程操作。

二、实验原理

培育基、温度、pH值、通风、搅拌、泡沫等因素会对发酵进程产生重要阻碍，因此对重要的参数进行操纵是顺利进行发酵的前提和保证。

依照发酵菌种对温度、pH值的要求不同，因此在发酵进程中要采取不同的温度和pH，以使发酵进程能够顺利进行，从而达到预期的目标。

适当的溶氧对微生物菌株的发酵进程具有重要的阻碍，保证必然的溶氧就必需对通风量及搅拌转速进行适当的调剂。

三、实验材料、仪器与试剂

材料：

谷氨酸发酵二级种子培育液；发酵培育基；谷氨酸发酵液不同发酵时刻所取样品；谷氨酸发酵液。

仪器：

蒸汽发生器；发酵罐及操纵系统；空气紧缩机；补料瓶；补料针；硅胶管；滴定管；滴定管架；电炉；烧杯；1000mL容量瓶、150mL锥形瓶；高速离心机；分光光度计；恒温水浴锅；三角瓶；小试管；烧杯；玻棒等。

试剂：

无水乙醇；葡萄糖；硫酸镁；磷酸氢二钾；氢氧化钾；糖蜜；硫酸亚铁；硫酸锰；尿素、消泡剂；去离子水；硫酸铜；亚甲基蓝；酒石硫钾钠；氢氧化钠；亚铁氢化钾；盐酸；L-谷氨酸分析纯；茚三酮；丙酮；酒精等。

四、实验步骤

（一）谷氨酸的中糖发酵及操纵

1清洗发酵罐，配制好5L发酵培育基，灭过菌的400ml40%尿素及400ml消泡剂；

2对发酵罐进行空消；

3加入5L的发酵培育基，对发酵罐进行实消；

4在接种槽中加好酒精并点燃，把二级种子培育基从接种口倒进发酵罐中进行发酵；

5对谷氨酸发酵进程中各项指标进行测定及操纵。

◆温度的操纵

◆溶氧量的操纵

◆通气量的操纵

◆OD值的测定直接用分光光度计，在波长600nm下测得OD值；

◆pH值的测定用pH试纸进行测定，pH要操纵在那个范围内；

◆谷氨酸含量的测定

◆还原糖含量的测定

（二）谷氨酸发酵进程还原糖含量的测定

a试剂配制（斐林试剂）

甲液：

五水硫酸铜3.5g，亚甲基蓝0.005g，用水溶解并稀释至100ml；

乙液：

酒石酸钾钠11.7g，氢氧化钠12.64g，亚铁氢化钾0.94g，用水溶解并稀释至100ml；

%标准葡萄糖溶液：

取葡萄糖1g，用少量水溶解，转至1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释定容至1000ml，摇匀；

b斐林试剂的标定

甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加水10ml，从滴定管中预先加入约%标准葡萄糖溶液，摇匀。

于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下以每秒一滴的速度加入%标准葡萄糖溶液，至蓝色恰好消失为终点。

记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的整体积。

同法平行操作3次，取接近两次体积的平均值为V0。

c滴定

甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加入发酵液，摇匀后于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下以每秒一滴的速度加入%标准葡萄糖溶液，至蓝色恰好消失为终点。

记录消耗的标准葡萄糖溶液的整体积V2.

d计算公式

还原糖（以葡萄糖计g/100ml）=（V0-V2）×C×1/V1×100【V0=；C=%；V1=】

（三）谷氨酸含量的测定

a谷氨酸标准曲线的绘制

◆标准样品的制备L-谷氨酸纯品梯度稀释溶液：

别离称取-0.5g分析纯L-谷氨酸,并别离溶解到100ml蒸馏水中，调剂。

◆茚三酮试剂的制备称取0.5g茚三酮溶于100ml丙酮。

◆pH调剂试剂的制备2mol/LNaOH溶液：

称取80gNaOH溶于100mL蒸馏水中；1mol/LHCL溶液：

量取36mL蒸馏水中。

◆标准溶液OD569值的测定取20支试管，别离加入3ml配制好的（0.）g/100ml的L-谷氨酸纯品溶液各两管，每支试管别离沿试管壁加入茚三酮试剂，摇匀，迅速置于80℃水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以蒸馏水为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。

以OD569值为纵坐标，绘制标准曲线。

b发酵液谷氨酸含量测定

谷氨酸发酵液11400r/min，离心5min，取上清，蒸馏水稀释100倍，调剂pH值，取3ml预处置好的发酵液加入15mm×150mm试管，调整pH值左右，沿试管壁加入茚三酮试剂，混匀，迅速置于80℃水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以100稀释的空白发酵培育基为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。

从标准曲线上查出相应L-谷氨酸浓度。

结果与分析

一、谷氨酸菌种的制备结果

一级菌液OD600=pH=

二级菌液OD600=pH=

二、谷氨酸含量的测定结果

1）标准曲线数据：

时间（h）

0

1—3

4

5—7

8

9—11

12

13—15

16

温度

32

32

32

32

pH

DO值

通风量

2．3

OD600

还原糖含量滴定用量（ml）

还原糖含量（g/100ml）

谷氨酸含量（OD569）

谷氨酸含量（g/100ml）

时间（h）

17—19

20

21—23

24

25—27

28

29—31

32

33—35

温度

pH

DO值

通风量

50

OD600

还原糖含量滴定用量（ml）

还原糖含量（g/100ml）

谷氨酸含量（OD569）

谷氨酸含量（g/100ml）

时间（h）

36

37—19

40

41—43

44

45—47

48

49

50

温度

pH

DO值

通风量

OD600

还原糖含量滴定用量（ml）

还原糖含量（g/100ml）

谷氨酸含量（OD569）

谷氨酸含量（g/100ml）

2）标准曲线绘制如下：

3、谷氨酸发酵进程

1）谷氨酸发酵上罐

谷氨酸棒杆菌

4、实验分析:

实验通过平板划线分离菌种的方式取得单个菌落，图中能够看出，单菌落的形态、大小、颜色比较一致，能够用作一级、二级种子的培育。

谷氨酸发酵是成立在容易变更的代谢平稳上，受多方面的环境条件支配。

环境适应，谷氨酸产生菌能将50%以上的糖转化为谷氨酸，副产品较少。

若是环境条件不适宜，谷氨酸几乎不产生，可能会合成乳酸、琥珀酸等代谢产物。

因此，需要对发酵进程进行严格操纵。

温度对于发酵是超级重要的，从酶反映动力学来看，温度升高，反映速度加速，代谢产物速度提早。

由谷氨酸发酵中温度及还原糖随时刻转变曲线图能够看出，发酵进程中，温度严格操纵在30～36℃之间，在32～36h内，温度多数接近36℃，符合谷氨酸发酵中温度的要求。

从而，能够排除温度在发酵进程中对谷氨酸代谢产物合成的阻碍。

发酵进程中，营养成份的利用和代谢产物的积存，使发酵液的PH不断转变，假设阴离子氮源被利用后产生NH3，那么pH上升。

有机酸的积存，使pH下降，培育基pH在发酵进程中能被菌体代谢所改变。

而PH的转变又会间接阻碍到膜渗透性，进而阻碍到营养物质的吸收和代谢产物的分泌。

因此，在谷氨酸发酵进程中，需操纵好PH。

谷氨酸发酵中PH及通风量随时刻的转变曲线说明，PH通过尿素流加法，严格操纵在6～8之间，在发酵进程中，由于没有PH电极，不能及时得知发酵液的PH值，因此难以操纵在6～8之间。

供氧对菌体的生长和谷氨酸的积存都有专门大的阻碍，假设在生长期，供氧不足，会抑制菌体的生长，从而致使副产物乳酸的积存。

有图标看出，在前8小时左右，DO值不断下降，这是由于发酵前期，谷氨酸棒杆菌增殖耗氧的缘故。

第18小时左右DO值开始上升，谷氨酸棒杆菌增殖减缓。

还原糖是谷氨酸发酵进程中的要紧检测操纵参数，当还原糖的含量降至1%以下，说明谷氨酸的发酵已经完成。

图表看出还原糖含量不断降低，可是谷氨酸含量有个先增加后降低的趋势，可能是发酵后期，谷氨酸分解的缘故。

谷氨酸的等电回收，并未取得谷氨酸的结晶体，可能是人工操作失误，无法结晶。

总结：

此实验比较失败……

实验二啤酒发酵工程系列实验

（一）协定法糖化实验

一、实验目的

了解协定法糖化实验的原理，并把握这种糖化法的操作。

二、实验原理

利用麦芽所含的各类酶类将麦芽中的淀粉分解成可发酵性糖类，蛋白质分解为氨基酸，碘遇淀粉显蓝色，从而判定可发酵性糖类的浓度。

三、实验材料、仪器与试剂

材料麦芽、麦芽汁

仪器水浴锅、烧杯、瓷板、玻棒、温度计、纱布、胶头滴管、恒温水浴锅

试剂碘化钾

四、实验步骤

A实验室糖化器的预备由水浴锅和1000ml的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻璃棒搅拌。

实验时杯内液面应始终低于水浴液面。

B碘溶液配制2.5g碘化钾溶于水中，稀释到100ml；

C协定法糖化麦芽汁的制备

1）用植物粉碎机将麦芽粉碎，称取75g；

2）在已知质量的糖化杯中放入75g麦芽粉，加300ml46-47℃的水，于不断搅拌下在45℃水浴中保温1h；

3）使酶液以每分钟升温1℃的速度，升温加热水浴锅，在25min内升至70℃，现在于杯内加入150ml70℃的水；

4）70℃保温2h；

5）每隔10min用玻璃棒取麦芽汁一滴，置于白滴板上，再加1滴碘液，混匀，观看颜色转变，直至碘液不变色为止；

6）在10-15min内急速冷却到室温；

7）用纱布将麦芽汁进行过滤，将滤液转移到蓝口瓶中；

8）用八层纱布将瓶口封好；

9）高压灭菌30min。

（二）啤酒酵母的扩大化培育

一、实验目的

学习酵母菌种的扩大培育方式，为实验室啤酒的发酵预备菌种。

二、实验原理

在啤酒发酵中，接种量一样应为麦芽汁量的10%（使发酵液中的酵母量达1×107个酵母/毫升），因此，要进行大规模的发酵，第一必需进行酵母菌种的扩大培育，扩大培育的目的一方面是取得足量的酵母，另一方面是使酵母由最适生长温度（28℃）慢慢适应为发酵温度（10℃）。

三、实验材料、仪器与试剂

材料啤酒酵母发酵菌种培育液

仪器恒温培育箱；生化培育箱；显微镜等。

试剂麦芽汁平板；麦芽汁培育液

四、实验步骤

利用糖化后的麦芽汁50ml+1g的琼脂粉配制成固体培育基，灭菌后倒两个平板。

另外将50ml的麦芽汁倒到100ml的锥形瓶中，高压灭菌

1）接种：

将不同品牌的啤酒酵母用划线法接到麦芽汁培育基中；

2）培育：

在28℃中培育48h后挑取假设干个菌落接到50ml麦芽汁中；

3）28℃中培育12h后，每隔一小时摇5min，并将温度调低1℃，明白温度降到12℃为止。

（三）啤酒主发酵及各项指标的测定

一、实验目的

学习啤酒发酵的进程，把握酵母发酵规律；学习用血球计数板计数酵母数量的方式；学习酵母菌种的质量鉴定方式；学习用糖锤度计测定糖度的方式；把握PH的测定方式，监测啤酒发酵的进程；了解用目视比色法的、测定啤酒色度的方式，监测发酵液的质量。

二、实验原理

啤酒主发酵时静置培育的典型代表。

是将酵母接种至盛有麦芽汁的容器中，早必然温度下培育的进程。

由于酵母菌是一种兼性厌氧微生物，先利用麦芽汁中的溶解氧进行好氧生长，然后利用EMP途径进行厌氧发酵生成酒精。

按期摇动容器既能增加溶氧，也能改善液体各成份的流动，最终加速菌体的生长进程。

分析其他指标，应从取样口取样测定。

三、实验材料、仪器与试剂

材料啤酒酵母；啤酒酵母发酵菌液。

仪器玻璃缸；生化培育箱；显微镜；恒温水浴锅；恒温箱；高压蒸汽灭菌锅；带刻度的锥形离心管；PH计；糖锤度计；100mL比色管；白瓷板；吸管；玻璃杯等

试剂麦芽汁培育基；灭菌水；L碘标准溶液；美篮；葡萄糖；蛋白胨；醋酸钾；琼脂等。

四、实验步骤

1）将糖化好的的麦芽汁装在蓝口瓶中，加葡萄糖调剂糖度到10Bx，定容至600ml，用八层纱布封好口以后，灭菌30min；

2）在接种前先将麦芽汁培育基摇匀；

3）将扩大培育中的50ml酵母培育液转接到麦芽汁培育基中，摇匀；

4）将接好种的麦芽汁培育基放到10℃的生化培育箱中培育，每6小时摇瓶充氧5min，每24h取样测量啤酒发酵的各项指标，指标包括：

糖度、细胞浓度、出芽率、细胞死亡率、还原糖、色度、pH。

5）糖度达到4Bx后停止发酵；

（一）啤酒酵母的计数

1）取清洁的血球计数板一块，平放于桌面，在计数室上方加盖盖玻片；

2）取酵母菌液（发酵液）10um加190um水稀释20倍（依如实际需要稀释所稀释倍数），用移液枪吸取稀释后的菌液滴至盖玻片边缘，让菌液渗入计数室内，计数室内不能有气泡；

3）静置5min，让酵母细胞稳固附着于计数室内；

4）将计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室的方格网，并移至视野中间；

5）转用高倍镜，找到计数室位置开始计数；

6）计算公式：

酵母细胞数/ml=大格中的细胞总数×10000×稀释倍数

7）用完血球计数板后马上清洗干净。

（二）啤酒酵母的质量检查

1）试剂配制%美蓝水溶液100ml，0.025g美蓝溶于100ml水中。

2）死亡率检查取一滴稀释后的菌液加一滴的%美蓝水溶液混匀，在将其滴至血球计数板盖玻片边缘，使其渗入，取5个视野计算被染色的细胞与总细胞数，计算死亡率。

3）出芽率检查能够跟检查死亡率一路进行，在检查死亡率的视野中数出出芽的细胞个数，计算出芽率。

（三）还原糖的测定

1）试剂配制（斐林试剂）：

甲液：

五水硫酸铜3.5g，亚甲基蓝0.005g，用水溶解并稀释至100ml；

乙液：

酒石酸钾钠11.7g，氢氧化钠12.64g，亚铁氢化钾0.94g，用水溶解并稀释至100ml；

%标准葡萄糖溶液：

取葡萄糖1g，用少量水溶解，转至1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释定容至1000ml，摇匀；

2）斐林试剂的标定

甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加水10ml，从滴定管中预先加入约%标准葡萄糖溶液，摇匀。

于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下以每秒一滴的速度加入%标准葡萄糖溶液，至蓝色恰好消失为终点。

记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的整体积。

同法平行操作3次，取接近两次体积的平均值为V0。

3）滴定

甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加入发酵液，摇匀后于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下以每秒一滴的速度加入%标准葡萄糖溶液，至蓝色恰好消失为终点。

记录消耗的标准葡萄糖溶液的整体积V2.

4）计算公式还原糖（以葡萄糖计g/100ml）=（V0-V2）×C×1/V1×100

（四）糖度的测定用糖度仪测动身酵液的糖度，再依照公式换算出plato值。

（五）pH值的测定直接用pH试纸进行测定

（六）色度的测定取2支比色管，一支中加入5ml蒸馏水，另一支加入5ml离心后的啤酒发酵液，用白色纸张为背景，用1ml移液管吸取碘液，逐滴滴入装水的比色管中，并非断振荡比色管使其混匀，直至从轴线方向观看其颜色与样品比色管相同为止，记下所消耗的碘液体积（ml，精准至小数点后两位）

样品的色度=10MV，M为碘标准溶液物质的量浓度。

（四）结果与分析

一、啤酒质量品评

表1淡色啤酒的给分扣分标准

类别

项目

满分要求

缺点

扣分标准

样品

外观

10分

透明度5分

迎光检查

清亮透明，

无悬浮物

或沉淀物

清亮透明

0

-2

光泽略差

1

轻微失光

2

有悬浮物或沉淀

3~4

严重失光

5

色泽5分

呈淡黄绿色

或淡黄色

色泽符合要求

0

-1

色泽较差

1~3

色泽很差

4~5

评语

由成品看来，不够透明，沉淀也比较多，颜色有点暗沉。

泡沫性能

15分

起泡2分

气足，倒入杯中有明显泡沫升起

气足，起泡好

0

-1

起泡较差

1

不起泡沫

2

形态4分

泡沫洁白

洁白

0

-1

不太洁白

1

不洁白

2

泡沫细腻

细腻

0

-1

泡沫较粗

1

泡沫粗大

2

持久6分

泡沫持久，

缓慢下落

持久4min以上

0

-3

3~4min

1

2~3min

3

1~2min

5

1min以下

6

挂杯3分

杯壁上附有泡沫

挂杯好

0

-1

略不挂杯

1

不挂杯

2~3

喷酒缺陷

开启瓶盖时，

无喷涌现象

没有喷酒

0

0

略有喷酒

1~2

有喷酒

3~5

严重喷酒

6~8

评语

本组做的啤酒泡沫有点少但泡沫质量基本还是符合要求的。

啤酒香气

20分

酒花香气

4分

有明显的

酒花香气

明显酒花香气

0

-1

酒花香不明显

1~2

没有酒花香气

3~4

香气纯正

12分

酒花香纯正

无生酒花香

酒花香气纯正

0

-1

略有生酒花味

1~2

有生酒花味

3~4

香气纯正

无异香

纯正无异香

0

-1

稍有异香味

1~4

有明显异香

5~8

无老化味

4分

新鲜，

无老化味

新鲜无老化味

0

0

略有老化味

1~2

有明显老化味

3~4

评语

啤酒香气虽然有，但是不浓烈，也不够清醇。

酒体口味

55分

纯正

5分

应有纯正

口味

口味纯正，无杂味

0

0

有轻微的杂味

1~2

有较明显的杂味

3~5

杀口力

5分

有二氧化碳

刺激感

杀口力强

0

-2

杀口力差

1~4

没有杀口力

5

苦味

5分

苦味爽口

适宜，无

异常苦味

苦味适口，消失快

0

-4

苦味消失慢

1

有明显的后苦味

2~3

苦味粗糙

4~5

淡爽或醇厚

5分

口味淡爽

或醇厚，

具有风味

特征

淡爽，不单调

0

-2

醇厚丰满

0

酒体较淡薄

1~2

酒体太淡，似水样

3~5

酒体腻厚

1~5

柔和协调

10分

酒体柔和、

爽口、谐调，

无明显异味

柔和、爽口、谐调

0

-2

柔和、谐调较差

1~2

有不成熟生青味

1~2

口味粗糙

1~2

有甜味、不爽口

1~2

稍有其它异杂味

1~2

口味缺陷

25分

不应有明显

口味缺陷

（缺陷扣分

原则：

各种

口味缺陷分

轻微、有、

严重三等酌

情扣分）

没有口味缺陷

0

-2

有酸味

1~5

酵母味或酵母臭

1~5

焦糊味或焦糖味

1~5

双乙酰味

1~5

污染臭味

1~5

高级醇味

1~3

异脂味

1~3

麦皮味

1~3

硫化物味

1~3

日光臭味

1~3

醛味

1~3

涩味

1~3

评语

口味上真正的纯生，但是始终有一点杂味，口感不是很纯

总体评价：

总的来说，此次啤酒实验成品还是一般。

总计减分

25

总计得分

75

二、实验分析

啤酒发酵数据统计

一级麦芽

二级麦芽

第一天

第二天（）

第三天（）

第四天（）

第五天（）

PH

OD

计数

无

×107

×107

×107

×107

质检死亡率

1%

2%

5%

5%

%

糖度

出芽率

无

无

无

无

无

啤酒酵母在必然条件下，以麦汁所含的可发酵性营养物质为底物而进行一系列生物化学反映合成啤酒。

因此，麦汁的糖化结果直接阻碍到发酵成效。

在协定法糖化进程中，显现糖化时刻太长和糖度不够的现象。

因素有：

A、α-淀粉酶活力偏低，不能使淀粉快速液化以造成β-淀粉酶分解的条件，也能造成糖化时刻延长。

B、麦芽尽管酶活力正常，但脆度低、粗细粉差高，在粉碎度不够的情形下仍会致使糖化时刻延长。

酵母的生理状态将会阻碍整个发酵进程的质量，本小组选用的是珠江啤酒酵母，通过平板划线，取得较多的酵母菌落，能够用于一级种子和二级种子的制备（忘了拍照）

酵母发酵进程，各生化指标的转变直接反映动身酵的质量。

酵母的浓度可阻碍啤酒发酵时刻的长短。

由于操作误差，酵母死亡率计数不准确

发酵终止后，由于糖度仪显现问题，最后的唐都不确信多少，可是啤酒色泽，香味都比较不错，口感也还能够，整体比较成功。

实验三青霉素发酵

一、实验目的

一、通过青霉素发酵，对抗生素发酵有一个初步了解。

二、把握抗生素发酵进程中一些重要生理指标。

二、