化妆品中克雷伯氏菌的检测方法.docx

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化妆品中克雷伯氏菌的检测方法

出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法

计划编号：

2009B136

编制说明

项目承担单位：

中国检验检疫科学研究院

项目负责人：

赵贵明

项目起止时间：

2010.1-2010.10

二〇一〇年十月

《出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法》

编制说明

一、工作情况和任务来源

1.任务来源

本部分为国家质量监督检验检疫部门下达的2010年度制标任务计划，计划编号为2009B136。

2.标准制订的工作过程

①标准的申报；②资料查询整理；③制定工作计划；④标准方法的验证；⑤按照GB/T1.1-2000进行标准和编制说明的起草并送专家征求意见；⑥总结反馈信息和意见对标准进行改进；⑦整理资料申报有关部门审定。

3.完成单位：

中国检验检疫科学研究院、珠海出入境检验检疫局、陕西出入境检验检疫局、吉林省产品质量监督检验院、北京奥博星生物技术有限公司。

4.标准起草人：

本标准第1部分主要起草人：

赵贵明张琦王小玉赵勇胜史艳宇杨海荣胡玥冯家望葛秋惠。

本标准第2部分主要起草人：

史艳宇赵贵明邴炜王娉华蕾

二、编制本标准的目的和意义

近几年，我国果蔬汁出口贸易稳步上升，2006-2007榨季，中国浓缩苹果汁出口量就达到104万吨，占到国际市场贸易总量的67%，成为我国食品工业中发展最快的行业之一，预计到2010年用于果汁加工的水果总量将达到2482万吨，而腐败微生物是既农残之后成为影响果蔬汁产品质量及国际贸易的主要因素。

在果蔬汁生产过程中，从原料到产品要经过选果-清洗-压榨-酶解-超滤-脱色-浓缩（杀菌）环节，由于原料、环境、空气中存在环脂芽孢杆菌及其芽孢，不可避免将芽孢带入成品中，即使在酸性条件下经过巴氏杀菌仍不能将其灭活，产品放置一段时间后，芽孢萌发，在代谢过程中产生愈创木酚和2,6-二溴苯酚，有类似“草药味”或“防腐剂”的不爽味道,1×10-12的含量就能造成果汁风味败坏并产生轻微沉淀。

为此，从1999年，美国等进口国要求浓缩果汁中嗜酸耐热菌小于1个／10ml（g）；2001年欧洲大部分果汁消费国也提出相同指标要求，而到2002年后，对50ml浓缩果汁中嗜酸耐热菌不得检出几乎成为常规指标，目前阳性样品的比例约为2％，其比例已高于其他食品中的病原微生物。

导致果蔬汁腐败的微生物，细胞膜含有共同的ω-环状脂肪酸，1992年Wisotzkey等人根据16SrDNA基因序列分析结果，将它们从芽孢杆菌属（Bacillus）中划分出来，成立一新属，命名为环状脂肪酸芽孢杆菌属（Alicyclobacillus），简称为环脂芽孢杆菌，该属菌目前包括8个种、2个亚种。

由于目前企业缺乏快速、有效的检测和监控手段，使得产品流通到消费者手中腐败才会被发现，成为浓缩果汁生产厂家最为棘手的问题。

目前已有果汁中检测环脂酸芽孢杆菌的方法，如日本果汁协会耐酸耐热菌统一检测方法、美国库克实验室耐热耐酸菌的检测方法、日本NDM公司耐热耐酸菌的检测方法、美国雀巢公司耐热耐酸菌检测方法等，但国内外没有标准方法，不同实验室采用不同检测方法，常使检测结果存在差异，直接影响了我国果蔬汁的出口贸易。

因此，制订检验标准，将大力推进产业发展，保障我国果蔬汁出口贸易顺利进行。

三、标准的主要内容依据

本标准共分为二个部分，第1部分“分离与计数方法”的内容参照国际果汁生产商联合会（InternationalFederationofFruitJuiceProducters,IFU）颁布的“导致果汁变质的果汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法”（MethodontheDetectionofTaintProducingAlicyclobacillusinFruitJuice）2007版进行实践研究，并通过试验和验证后制订。

第2部分“荧光PCR方法”为快速筛选方法，参考文献“Developmentofareal-timePCR-basedsystemtargetingthe16SrRNAgenesequenceforrapiddetectionofAlicyclobacillusspp.injuiceproducts”（InternationalJournalofFoodMicrobiology99（2005）229–235），并通过试验和验证后制订。

第1部分分离与计数方法

本部分采用的样品处理方法、增菌方法、分离培养基及可疑菌落鉴定方法研究如下：

1材料

1.1培养基及试剂

1.1.1K琼脂

成分：

酵母提取物2.5g

蛋白胨5.0g

葡萄糖1.0g

吐温801.0g

琼脂15.0g

制法：

将上述成分混合，加入1L去离子水。

121℃高压灭菌15min。

冷却至50℃，用25%苹果酸调节pH值至3.7。

1.1.2YSG琼脂及YSG肉汤

成分：

酵母提取物2.0g

葡萄糖1.0g

可溶性淀粉2.0g

琼脂15.0g

制法：

将上述成分混合，加入1L去离子水。

121℃高压灭菌15min。

冷却至50℃，用1N盐酸调节pH值至3.7。

YSG肉汤：

成分同YSG琼脂培养基，但不包括琼脂。

调节pH值后再121℃高压灭菌15min。

1.1.3BAT琼脂及BAT肉汤

成分：

CaCl2.2H2O0.25g

MgSO4.7H2O0.50g

（NH4）2SO40.20g

KH2PO43.0g

酵母提取物2.0g

葡萄糖5.0g

痕量矿物质溶液1.0mL

去离子水500mL

用1NH2SO4或者1NNaOH调节pH值至4.0。

121℃高压灭菌15min后冷却至50℃。

痕量矿物质溶液：

A）CaCl2.2H2O0.66g

ZnSO4.7H2O0.18g

CuSO4.5H2O0.16g

MnSO4.H2O0.15g

COCl2.6H2O0.18g

H3BO30.10g

NaMoO4.2H2O0.30g

去离子水1000mL

高压灭菌后于冰箱中保存。

B）琼脂15g~20g

去离子水500mL

121℃高压灭菌15min后冷却至50℃。

无菌等体积混合A.4.1和A.4.2，必要时调节pH值至4.0，倒平板。

BAT肉汤：

成分同BAT琼脂培养基，但不包括琼脂。

调节pH值后再121℃高压灭菌15min。

1.1.4香草酸：

100mg/kg。

1.2试验菌株

环状脂肪酸芽孢杆菌：

1）AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43030，

2）AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43031，

3）AlicyclobacillusacidocaldariusATCC43033，

4）AlicyclobacillusacidoterrestrisATCC49025，

5）AlicyclobacillusacidoterrestrisATCC49027，

6）AlicyclobacilluscycloheptanicusATCC49029，

7）Alicyclobacillusacidocaldariussubsp.AcidocaldariusATCC27009，

8）AlicyclobacillussendaiensisATCCBAA-609，

9）Alicyclobacillussp.ATCCBAA-757，

10）AlicyclobacillusvulcanalisATCCBAA-915，均购自美国典型培养物保藏中心。

菌种按照ATCC提供的培养基和培养条件复苏后分别接种ATCC要求的培养基培养后备用。

其他参考菌株：

枯草芽孢杆菌IQCC22734；蜡样芽孢杆菌IQCC22735，地衣芽孢杆菌IQCC22736，来自中国中国检科院食品安全研究所菌种保藏中心。

1.3实验样品

样品基质为浓缩苹果汁，样品来源于陕西出入境检验检疫局微生物实验室保存样品。

本实验所用实验样品，6份。

原始标号分别为经采用本标准制定的出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌检测方法检测，结果均为阴性。

表1果汁样品编号

实验编号

原始编号

原产地

1

070104-5245

山西

2

070113-7137

山西

3

070121-5263

山西

4

061017-10395

陕西

5

2807075-61101

陕西

6

2807077-61103

陕西

2.方法与结果

2.1增菌培养

环状脂肪酸芽孢杆菌43030、43031、43033、49025、49027、49029、27009、BAA-609、BAA-757、BAA-915以及枯草芽孢杆菌；蜡样芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌的菌液1ml，分别接种于10mlBAT肉汤和YSG肉汤，置培养箱45℃±1℃培养2d，观察试验菌株其在不同肉汤中的生长情况（见表2），经观察环状脂肪酸芽孢杆菌在BAT肉汤和YSG肉汤中生长差异不大，但其他芽孢杆菌不生长。

表2.实验菌株在不同肉汤中的生长情况

培养液

菌种号

BAT增菌液

YSG增菌液

43030

+++

+++

43031

+++

+++

43033

+++

+++

49025

++++

++++

49027

++++

++++

49029

+++

+++

27009

+++

+++

BAA-609

+++

+++

BAA-757

+++

+++

BAA-915

+++

+++

22734

-

-

22735

-

-

22736

-

-

2.2.分离培养

环状脂肪酸芽孢杆菌43030、43031、43033、49025、49027、49029、27009、BAA-609、BAA-757、BAA-915以及枯草芽孢杆菌；蜡样芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌7316的菌液，各取一环，四区法划线接种于BAT、YSG和K琼脂平板，45℃±1℃培养48h-32h,观察实验菌株在上述平板上的生长情况，见表3。

表3实验菌株在不同平板上的生长情况及菌落形态

平板

菌株

K琼脂

YSG琼脂

BAT琼脂

生长

形态

生长

形态

生长

形态

43030

-

++

菌落扁平，边缘不规则，无色

+++

菌落扁平，边缘不规则，无色

43031

-

++

菌落扁平，边缘不规则，无色

+++

菌落扁平，边缘不规则，无色

43033

-

++

菌落扁平，边缘不规则，无色

+++

菌落扁平，边缘不规则，无色

49025

++++

菌落圆形，较大，白色，不透明

++++

菌落圆形，较大，黄白色，不透明

++++

菌落圆形，较大，黄白色，不透明

49027

++++

菌落圆形，较大，白色，不透明

++++

菌落圆形，较大，黄白色，不透明

++++

菌落圆形，较大，黄白色，不透明

49029

-

++

菌落圆形，较小，黄白色，不透明

+++

菌落圆形，较小，黄白色，不透明

27009

-

++

菌落圆形，较小，黄白色，不透明

+++

菌落圆形，较小，黄白色，不透明

BAA-609

-

++

菌落圆形，微黄色，湿润中心凸起

+++

菌落圆形，微黄色，湿润中心凸起

BAA-757

-

++

菌落圆形，微黄色，湿润中心凸起

+++

菌落圆形，微黄色，湿润中心凸起

BAA-915

-

++

菌落圆形，微黄色，湿润中心凸起

+++

菌落圆形，微黄色，湿润中心凸起

22734

-

-

-

22735

-

-

-

22736

-

-

-

注：

“+”为生长情况，“-”为不生长。

图1ATCC43030在YSG培养基上的菌落特征

（菌落圆形，黄白色，不透明或半透明）

2.3显微镜检和芽孢染色

（1）从K琼脂平板平板上挑取45℃±1℃培养48h的ATCC43030和ATCC49025菌落，作涂片、干燥、固定；

（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上；

（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。

加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。

这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。

（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。

（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

图2ATCC43030的染色图片（菌体为红色，芽孢呈绿色）

2.4样品检测步骤

（1）样品的稀释

使用适当的灭过菌的工具和容器无菌采集具有代表性的样品，平行称取310g样品，其中2份样品用蒸馏水进行1：

10稀释，其余1份样品用YSG肉汤进行1：

10稀释，混匀。

（2）热处理

将样品稀释液置于80℃±1℃恒温水浴锅中，水面高度须超过样品高度，使样品稀释液温度5min内上升至79℃~80℃，加热10min。

取出样品稀释液，冷却至40℃~45℃，可用含冰的凉水进行冷却。

（3）滤膜法计数

将2个100mL热处理过的样品稀释液，用直径0.45μm的滤膜进行过滤，用20mL清洗液（如无菌去离子水）冲洗滤膜后，无菌取出滤膜，将第一个膜置于K琼脂上，另一个膜置于YSG琼脂上，避免气泡产生。

与此同时，将对照菌株A.acidoterrestrisATCC45025和A.acidocaldariusATCC43030在相同平板上划线。

（4）直接涂布平板（直接计数）

取0.1mL热处理样品接种于K琼脂和YSG琼脂或BAT琼脂上。

与此同时，将对照菌株A.acidoterrestris和A.acidocaldarius在相同平板上划线。

（5）平板培养

将所有平板和增菌肉汤于45℃±1℃培养2d~5d，观察有无菌落生长，在培养过程中可以将平板置于密封袋或其他密封容器中来避免培养基干燥。

（6）增菌法定性检测

将100mL加热处理的样品于45℃±1℃进行增菌培养。

（7）增菌肉汤的传代培养

增菌培养2d后，轻混增菌肉汤，取一菌环菌液接种于K琼脂和YSG琼脂和BAT琼脂上进行传代培养，如果（至少培养2d）无典型的环状脂肪酸芽孢杆菌菌落生长，将肉汤增菌5d后，再进行传代接种。

传代培养的同时，将标准菌株A.acidoterrestrisATCC49025和A.acidocaldariusATCC43030进行划线培养。

（8）可疑菌确证试验

检查K琼脂，YSG和BAT琼脂上的菌落，选择每种菌落形态的2个菌进行确证试验。

从每个挑选的菌落一部分划线接种于一块K琼脂平板、一块中性pH培养基平板（如：

菌落计数平板、TSA或脑心浸液琼脂）和两个YSG琼脂平板，将其中1个YSG琼脂平板在65℃±1℃培养2d~3d，其余各平板在45℃±1℃培养3d~5d。

YSG和BAT能够支持目前已知的环状脂肪酸芽孢杆菌属中各个种的细菌生长，与K琼脂相比，更宽泛的环状脂肪酸芽孢杆菌会在两种培养基上生长出可见菌落。

2.5实验样品及人工添加实验样品检测结果

6份样品经本方法检测实验结果均为阴性。

选取1-4号样品进行人工添加实验，实验结果见表4

表4人工添加样品检测结果

样品编号与检测方法

K琼脂

YSG琼脂

BAT琼脂

450C

650C

pH4

pH7

1

滤膜法

-

+

-

+

-

涂布法

-

+

-

+

-

增菌法

-

+

-

+

-

2

滤膜法

+

+

-

+

-

涂布法

+

+

-

+

-

增菌法

+

+

-

+

-

3

滤膜法

+

+

-

+

-

涂布法

+

+

-

+

-

增菌法

+

+

-

+

-

4

滤膜法

-

-

-

-

-

涂布法

-

-

-

-

-

增菌法

-

-

-

-

-

注：

“+”为生长情况，“-”为不生长。

1号样品添加ATCC43030；2号样品添加ATCC49025；3号样品添加ATCC49027；添加量为10-100cfu/ml。

4号样品未添加。

3结论和说明

3.1检测原理说明

（1）环状脂肪酸芽孢杆菌通常以较低数量存在于果蔬汁中，因此选择灵敏度较高的滤膜法和增菌方法十分必要。

滤膜法和直接涂布法可定性和定量检测果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌，但二者检测低限不同，分别为1pfu/10g和1pfu/0.01g。

增菌法为定性检测方法。

（2）实验中的热休克处理十分必要，由于环状脂肪酸芽孢杆菌通常以芽孢形式存在于产品和成分中，热处理可以刺激芽孢的萌发和生长，同时对果蔬汁中可能存在的其他菌进行灭活。

（3）鉴于环状脂肪酸芽孢杆菌的生物特性，培养基中的酸化环境是必要的，YSG和BAT培养基支持目前已知的所有环状脂肪酸芽孢杆菌的生长，K琼脂支持多数情况下引起果蔬汁腐败的A.acidoterrestris的生长，而限制该属其他菌如A.acidocaldarius的生长，因此，K琼脂主要用于检测A.acidoterrestris。

（4）有必要对疑似环状脂肪酸芽孢杆菌进行确证试验，可通过在pH3.8的培养基上产生芽孢而在中性培养基上不能生长得到验证。

（5）目前已知产生愈创木酚的环状脂肪酸芽孢杆菌其过氧化物酶试验均为阳性，而且这些菌的生长温度低于65oC。

3.2方法中所用各平板的特点与主要用途

表4环状脂肪酸芽孢杆菌在三种培养基上生长特点与用途

优缺点

选择性平板

特点

用途

K琼脂

支持引起果蔬汁腐败的主要环状脂肪酸芽孢杆菌A.acidoterrestris的生长，对该属其他菌则限制生长

主要用于产生腐败气味的A.acidoterrestris的分离；镜检与芽孢染色检测

YSG琼脂

适合所用环状脂肪酸芽孢杆菌的生长

环状脂肪酸芽孢杆菌的增菌与分离培养；65oC验证实验

BAT琼脂

酸性生长环境下适合所有环状脂肪酸芽孢杆菌的生长，中性环境下适合所有芽孢杆菌的生长

pH值适应性验证试验，环状脂肪酸芽孢杆菌在pH3.8时生长，pH6时则不生长

四、标准的使用情况及验证

本技术标准经福建出入境检验检疫局、广东出入境检验检疫局、广西出入境检验检疫局、山西出入境检验检疫局和吉林出入境检验检疫局五家单位验证，验证结论：

本标准所建立的方法是技术路线合理，灵敏度及特异性高，可用于出口果蔬汁中环状脂肪酸芽孢杆菌的检验。

五、主要参考资料

1.MethodontheDetectionofTaintProducingAlicyclobacillusinFruitJuice.InternationalFederationofFruitJuiceProducters.IFUMB12，2007.

2.IsabelWalls,RolendaChlyate.IsolationofAlicyclobacillusacidoterrestrisfromFruitJuice.AOACInternational.2000,（83）5:

1115-1120.

3.WitthuhnRC,DuvenageW,GouwsPA.EvaluationofdifferentgrowthmediafortherecoveryofthespeciesofAlicyclobacillus.LettApplMicrobiol.2007,45

（2）:

224-229.

第2部分荧光PCR方法

1．检测对象及测试样品种类

1.1环状脂肪酸芽孢杆菌阳性菌株Alicyclobacillusspp.

（1）A.acidocaldarius（ATCC43030）；

（2）A.acidoterrestris（ATCC49025）。

1.2特异性验证所需菌株

（1）BacillussubtilisOSU494，枯草芽孢杆菌；

（2）EscherichiacoliDH-5a，大肠杆菌；

（3）GeobacillusstearothermophilusATCC10149，嗜热脂肪地芽孢杆菌；

（4）LactobacillusplantarumATCC8014，植物乳杆菌；

（5）LeuconostocmensenteroidsATCC15935；

（6）Lactococcuslactissubsp.LM2301，乳酸乳球菌；

（7）PseudomonasputidaATCC49451，恶臭假单胞菌。

以上各菌株均购自美国菌种保藏中心。

1.3培养基

1.3.1K液体培养基

1.3.1.1成分

蛋白胨5.0g

酵母提取物2.5g

葡萄糖1.0g

吐温-801.0g

蒸馏水1000.0mL

1.3.1.2制法

将各成分加入蒸馏水中溶解，用25%苹果酸调pH值至4.0±0.2。

121℃高压灭菌15min。

1.3.2其他培养基：

营养肉汤；LB肉汤；MRS肉汤；M17-G肉汤；胰蛋白胨大豆肉汤等均购自于北京陆桥有限公司。

2．检测方法研究

2.1增菌

Alicyclobacillusacidoterrstri，ATCC49025，Alicyclobacillusacidocal-darius，ATCC43030于402培养液中47℃培养24h~48h；BacillussubtilisOSU494于营养肉汤中37℃培养24h；Escherichiacoli于LB肉汤中37℃培养24h；GeobacillusstearothermophilusATCC10149于营养肉汤中55℃培养24h；LactobacillusplantarumATCC8014和LeuconostocmensenteroidsATCC15935均在MRS肉汤中37℃培养24h；LactococcuslactissubspLM2301在M17-G肉汤中30℃培养24h；PseudomonasputidaATCC49451于胰蛋白胨大豆肉汤中30℃培养24h。

2.2DNA的提取

分别取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量吸弃上清液；加入50μLDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混合后沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清液以待检测（如不能及时检验，可将上清液于-20℃保存）。

也可按细菌基因组试剂盒进行DNA提取。

2.3荧光PCR引物设计和筛选

根据环状脂肪酸芽孢杆菌属16SrRNA基因，在Genebank中检索到AlicyclobacillusstrainsATC