贝伐珠单抗原液生产车间工艺设计.docx

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贝伐珠单抗原液生产车间工艺设计

贝伐珠单抗原液生产车间工艺设计

贝伐珠单抗原液生产车间工艺设计

摘要

贝伐珠单抗是一种抑制血管内皮生长因子的人源化的单克隆抗体，广泛适用于转移性结直肠癌和晚期、转移性肺癌等多种肿瘤的治疗。

现如今不断对贝伐珠蛋白药物以及更多适应症的深入研究，贝伐珠单抗将成为重要的抗肿瘤血管生成药物，其蛋白药物将需要大规模工业化生产来满足市场需求。

本论文通过查阅贝伐珠单克隆抗体的生产工艺，利用分批补料方法对CHO细胞进行发酵培养并对贝伐单抗原液生产进行车间设计。

本设计主要为发酵和纯化车间的设计，包括物料衡算、热量衡算、厂房设计及设备选型等。

关键词：

贝伐珠单抗;生产工艺;物料衡算；厂房设计

PROCESSDESIGNOFBEVACIZUMABRAWSOLUTIONPRODUCTIONWORKSHOP

Abstract

Bevacizumabisahumanizedmonoclonalantibodythatinhibitsvascularendothelialgrowthfactor.Itiswidelyusedinthetreatmentofmetastaticcolorectalcancer,advancedandmetastaticlungcancerandothertumors.Nowadays,bevacizumabwillbecomeanimportantanti-tumorangiogenicdrugduetothecontinuousin-depthresearchonbevacizumabandmoreindications,anditsproteindrugwillneedlarge-scaleindustrialproductiontomeetthemarketdemand.Inthispaper,theproductionprocessofbevacizumabwasreviewed,andtheCHOcellswerefermentedandculturedwithbatchfeedingmethod,andtheproductionworkshopofbevacizumabwasdesigned.Thisdesignmainlyforfermentationandpurificationworkshopdesign,includingmaterialbalance,heatbalance,plantdesignandequipmentselection.

Keywords:

bevacizumab；productionprocess；materialbalance；plantdesign

1前言

1.1简介

贝伐珠单抗注射液是用于抑制血管内皮生长因子的一种人源化的单克隆抗体，用于联合化疗作为转移性结直肠癌、转移性乳腺癌、晚期非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌的一线治疗方案[1,2]。

贝伐珠单抗的药理作用与机制：

贝伐单抗可以通过选择性地与人体内血管内皮生长因子（VEGF）细胞相结合作用来有效减弱或阻止生长因子与VEGF细胞受体的相互结合，起到帮助肿瘤化疗药物更好地直接到达肿瘤内部或细胞间,最终有效地抑制了肿瘤内部血管的新生和细胞再生,从而充分发挥化疗持续抑制肿瘤血管生长的重要的作用[3]。

贝伐珠单抗特点：

1、广谱：

贝伐珠单抗在新生肿瘤血管生成具有针对性抑制能力

2、半衰期长:

贝伐单抗相比较其他药物下半衰期较长，大约20d

3、无交叉耐药:

不受细胞毒性药物耐药性影响

1.2贝伐珠单抗在肿瘤治疗领域的应用

1.2.1结直肠癌

据2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[4]显示结直肠癌在全国发病率、死亡率分别排第４、５位。

虽然结直肠癌可以通过手术切除，仍有20%-30%患者手术后出现复发或转移情况。

加上国内暂无全国性的结直肠癌筛查方案，导致大部分结直肠癌患者在就诊时己经发生转移[5]。

与以往的化疗和放疗为主治疗手段相比，贝伐珠单抗的出现与使用，在一线治疗方案中联合基础化疗贝伐珠单抗显著延长患者的总生存期和无进展生存期，并在二线治疗、维持治疗中，贝伐珠单抗均能给患者产生显著疗效。

1.2.2卵巢癌

随着若干项大型Ⅲ期临床研究数据证实在标准化疗方案的基础上联合使用贝伐珠单抗，不但能够提高患者的临床缓解率，延长生存时间，而且未明显增加不良反应的发生率[6,7]。

贝伐珠单抗逐渐得到认可，为耐药性卵巢癌和复发性卵巢癌的治疗带来了新的曙光。

1.2.3胃癌

在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，而临床收治的胃癌患者大部分为晚期，每年约60万的患者因胃癌死亡。

付红伟[8]研究发现贝伐珠单抗的联合治疗和单纯化疗相比，对胃癌患者疾病控制率有所收益，无严重不良反应发生。

所以，贝伐珠单抗联合化疗是可以考虑的方案，为晚期胃癌患者治疗增加了选择。

1.2.4非小细胞肺癌

贝伐珠单抗联合铂类是首个被临床证实与基础化疗方法联用可延长晚期非鳞非小细胞恶性肺癌（NSCLC）患者生存期的血管生成抑制剂[6]。

在多项成功的临床研究证实了贝伐珠联合铂类化疗能显著地延长肺癌患者的肿瘤生存期,使得贝伐珠单抗在晚期肺癌的治疗中继续占据重要的地位。

但由于目前缺乏明确的临床疗效预测和影响因子,这一问题成为了贝伐珠单抗在其使用的过程和治疗中的一个关键性问题。

1.2.5其他肿瘤

多项临床研究显示贝伐珠单抗的联合治疗在乳腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤等其他癌症应用上均有一定疗效，这给了临床上除了化疗外而一直没有更好的治疗选择的癌症的诊治带来了新的希望。

但贝伐珠单抗在这些癌症上尚处于起步阶段，并没有明确的证据证实它能延长患者总生存期，在联合用药、治疗时机及远期疗效等问题，需要进一步研究。

1.3用药不良反应

由于应用贝伐珠单抗会抑制VEGF，但VEGF在正常组织的生理活动中发挥重要作用，所以会导致一些反应程度轻微的不良反应发生，如高血压、蛋白尿等是常见的不良反应,对症处理即可[6]。

但对于严重威胁人体的不良反应需加大关注。

1.蛋白尿

在接受贝伐珠单抗治疗中，可能会因为单抗抑制VEGF而导致肾小球的滤过屏障受损，蛋白尿的发生与贝伐珠单抗的剂量相关。

所以根据检测出尿蛋白水平来判断是否中止相关贝伐珠的治疗方案。

2.高血压

通过对使用贝伐珠单抗治疗患者的观察，发现高血压的出现是常见的不良反应之一。

故在使用贝伐珠单抗治疗的过程中，监测出血压达到正常临界值以上，一般只需的服用抗高血压药物，就可以对高血压进行充分的控制。

3.血栓

与采用单独化疗的患者进行比较,患者在治疗中接受贝伐珠单抗和化疗的联合治疗后,可能会大大增加了静脉血栓发生的几率。

如果在治疗中发生了可能威胁到患者生命的静脉栓塞发生的事件,应该立即停用贝伐珠单抗。

4.其他

使用贝伐珠单抗后可能导致伤口愈合缓慢、伤口开裂、致死性出血的概率会增加，出现严重及致死性手术并发症的患者应暂停使用贝伐珠单抗。

1.4贝伐珠的发展概况

贝伐珠单抗的原研药企是罗氏（基因泰克），在2004年获得FDA批准上市。

于2017、2019年FDA先后批准安进和辉瑞公司生产贝伐珠单抗生物类似物Mvasi和Zirabev；2019年12月中国国家药监局批准齐鲁药业研制的贝伐珠单抗注射液上市，国内还有较多药企已经进入NDA、临床三期阶段，见表1。

随着不断对贝伐珠的研究，其在抗血管生成治疗领域中逐渐成为不可缺少单抗药物。

现如今使用贝伐珠单抗治疗的患者超过100万。

公司名称

适应症

状态

公示日期

信达生物

NSCLC

NDA

2019.1

百奥泰

NSCLC

Ⅲ

2019.12

复宏汉霖

CRC

Ⅲ

2017.1

嘉和生物

NSCLC

Ⅲ

2017.12

恒瑞医药

NSCLC

Ⅲ

2018.3

正大天晴

NSCLC

Ⅲ

2018.7

华兰生物

NSCLC

Ⅲ

2018.8

神州细胞

NSCLC

Ⅲ

2018.12

安科生物

NSCLC

Ⅲ

2019.4

东耀药业

NSCLC

Ⅲ

2017.5

北京天广实

NSCLC

Ⅲ

2017.8

山东博安生物

NSCLC

Ⅲ

2018.1

表1.1中国进入临床Ⅲ期及递交NDA申请的贝伐珠单抗生物类似药

1.5展望

根据近几年的全球癌症报告显示，我国的新发癌症人数最多。

2004年贝伐单抗成功研发且在癌症治疗领域起到重要作用，它的需求量在全球快速增加。

但是在2019年之前贝伐单抗都是从国外进口，直到现如今齐鲁药业通过中国国家药监局批准生产贝伐单抗，大多企业仍处于临床阶段。

因此，贝伐单抗在工业上的生产具有研究意义，本论文旨在研究贝伐珠单抗原液车间工厂设计，为实际工业生产提供参考价值。

本论文希望通过对发酵、纯化车间设计、设备选型等，能设计出比较符合实际生产的贝伐单抗车间,让生产效益最大化。

随着对联合化疗、分子靶向治疗及多种治疗手段的不断探索，我相信贝伐珠单抗将成为癌症治疗领域上重要支柱。

2贝伐珠单抗工艺流程设计

2.1生产工艺流程

贝伐珠生产工艺流程参见下图。

2.2生产工艺流程说明

2.2.1药物原液（DS）

药物原液（DS）生产工艺流程可分为上游和下游两部分，其中上游工艺为从种子复苏到蛋白捕获，下游工艺为从纯化到原液收获。

2.2.1.1种子复苏

将种子细胞从种子库中取出冻存管，37℃下水浴解冻，并不断的摇动，使之迅速融化。

用酒精消毒后打开，用移液枪吸出细胞的冻存液，加入事先装好培养基（37℃预热，8～10倍体积）的离心管内以稀释二甲基亚砜（DMSO），移液枪吹打成细胞悬液，然后在1000rpm下离心5min，去除上清液。

接种于含少量培养基（约30ml）的一次性摇瓶中，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养1h，使细胞复苏。

应用的培养基为Gibco公司生产货号为670006的CHOMedium，规格为10kg/桶的粉末状培养基。

该培养基是一种不含动物来源成分的配方，适用于研究和生产应用分批工艺、补料分批工艺和量产工艺的各种生物培养容器。

CHO培养基基础配制方法:

称取培养基26.0g于含有950ml注射用水的烧杯,缓慢搅拌使其溶解；然后加入1.9gNaHCO3;再次搅拌溶解，加注射用水定容至1L（所需pH可用NaOH或HCl溶液调节）；在0.2μｍ滤膜中正压过滤除菌。

2.2.1.2细胞扩增

复苏的细胞接种于培养基培养经过初步培养后，置于多个含培养基一次性摇瓶中培养悬浮培养，（形成约900ml的细胞液）接种密度维持在

，细胞活率维持在85％以上，在35℃下自然增殖分裂细胞数量pH控制在7.2~7.3，培养24h。

2.2.1.3一级反应器培养

待培养细胞经过扩增后转至10L的一次性生物反应器中，培养同时加入培养基，供细胞正常繁殖分化产生抗体，通入CO2和O2。

考虑到实际操作过程中，种子制备体积过大会增加前期培养时间，使培养发生污染的机率增大[9]。

所以确定反应器中的传代接种密度为

cells/ml。

2.2.1.4多级反应器培养

采用培养方法为分批补料培养法，在不同培养时间段中添加补料培养基，一次性收获产品。

生物反应器培养分4阶段，分别是10L、50L、200L、2000L，每个阶段均需加入培养液（Gibco提供、型号670006），加入不同量的发酵液满足不同阶段的容量。

种子密度达到

cells/ml接种，通常为2d左右。

在37℃下扩增培养，第2天补充5%基础培养基体积的补料培养基（Sigma-Aldrich公司提供，型号24368C）；细胞密度达到

，调整温度至30℃左右；第4、6、8天分别补10%、10%、5%基础培养基体积的补料培养基；当细胞活力低于

中止培养。

10L、50L、200L反应器培养为种子细胞培养阶段，加入的培养液分别为7.5L、37.5L、150L;培养条件：

温度为

，搅拌转速为

，溶氧（DO）为

和pH为7.0-7.2，总培养时间为6d。

2000L反应器为细胞生长阶段的抗体分泌阶段，加入培养液（Gibco提供、型号670006）的量为1500L，总培养时间为20d。

培养条件为：

温度为

，溶氧（DO）为

、搅拌转速为

和pH为7.2-7.4,。

2.2.1.5细胞收获

在反应器中培养一定时期后，收集细胞和细胞产生的抗体，随后将进行一系列的过滤层析和提纯，得到所需要的抗体。

2.2.1.6离心过滤

将收获的含有细胞及产生抗体的细胞液通过采用离心的方式将浆细胞与抗体分离开并过滤，取上清液继续亲和层析。

过滤条件为：

温度25~28℃，时间约2～3h。

过滤器在使用过程中会产生含细胞的冲洗废液L1，且细胞在离心过程中可能有部分会坏死，无论是否存活的细胞均被截留在过滤器中，成为固废。

2.2.1.7蛋白质捕获

先加入平衡液到层析柱上淋洗，再用分离得到上清液加样，然后用pH3.5洗脱缓冲液洗脱层析柱填料上结合的抗体，最后用较高浓度盐溶液去除强结合杂质，使得介质再生。

将离心过滤后抗体通过亲和层析进行第一步的纯化，层析温度为18~26℃，层析时间约2～3h，过程中会产生有不含抗体的细胞、缓冲液废液L2。

具体步骤如下：

①蛋白A介质填充于层析柱②层析柱由5cv平衡液清洗后上样，让样品在柱上保留4min③用3cv平衡液淋洗至A280基线，之后由5cv的缓冲液进一步冲洗，减少了亲和层析洗脱液中宿主蛋白的残留④再经2cv平衡液冲洗去除高浓度NaCl⑤目标蛋白最后由5cv蛋白洗脱液洗脱，线性流速4mL/min，1min停留时间。

⑥根据CEX-HPLC检测结果,合并收集样液，流速为2.0ml/min收集蛋白峰⑦最后用3cv的再生水冲洗层析柱再生，然后用3cv的消毒液冲洗层析柱，再用3cv的注射用水淋洗层析柱，保存在2cv的20%乙醇。

生产过程条件说明如下：

层析柱：

Axichrom450/550（即内径450mm,高度550mm）,床层体积为87.4L

填料：

rProteinASepharoseFastFlow（rPrA），货号17-1279-03，通用电气公司GE。

其每毫升介质结合量为50mg，即需要60L的填料。

层析系统：

AKTAprocess全自动可升级生产系统，型号AKTAprocess（GE公司）

操作系统：

unicorn系统（GE）

溶液：

平衡液：

50mmol/LHEPES，150mmol/LNaCl，pH7.0

缓冲液：

50mmol/LHEPES，1mol/LNaCl，pH7.0

蛋白洗脱液：

100mmol/L醋酸，pH3.5

再生液：

2mol/LNaCl

消毒液：

50mmol/LNaOH

2.2.1.8病毒灭活

在生产过程中可能会有病毒产生，污染的来源可以是原细胞系本身，也可能来自过程中、培养基、缓冲液等原辅料[10]偶然带入的外源病毒。

为确保产品的安全性，所以需要通过病毒灭活的步骤，现采用分离方法如下。

1.低pH病毒灭活

使病毒处于低pH环境下，改变病毒表面电荷，蛋白质的空间结构发生不可逆的变性，病毒丧失与细胞受体结合的能力，起到病毒灭活作用。

目前存在容器顶部和管道壁会有液滴未能接受很好的低pH病毒灭活的问题，考虑将混匀的溶液转移至另外一个容器。

2.纳滤膜

多数病毒直径在20~200nm，而纳米过滤膜的孔径平均为2nm,相对分子质量截留范围在在200~1000之间。

利用膜内有大大小小孔径可进行筛分，对纳米膜进行加压来除病毒过滤。

存在问题是小孔径的膜包被杂质堵塞，导致病毒从大孔径流出。

这里主要采用低pH灭活方法，用1.5倍注射用水稀释收集的样品，酸性溶液调节pH值至3.5左右，

下孵放

，完成病毒的灭活。

根据下一步阴离子交换层析需要，用高浓度、高pH值的Tris-HCl调节蛋白溶液pH值至7.2左右，此过程会产生酸性废液L3。

2.2.1.9离子交换层析

1.阴离子交换层析

经过初步纯化后的抗体溶液继续进入阴离子交换层析装置进一步纯化，它是去除内毒素和核酸的常用方法之一。

经查阅知贝伐株单抗等电点pI=8.25，故选择pH7.2Tris-HCl缓冲液作为平衡和洗涤缓冲液。

层析温度18~26℃,层析时间约2h，层析过程需要加入一定量的缓冲液,层析后有不需要的缓冲废液L4产生。

具体步骤如下：

①将强阴离子交换树脂填充于层析柱②用5cv平衡液清洗层析柱后上样，样品在柱上保留4min③用3v平衡液淋洗至至洗出液pH接近中性，之后由5cv的缓冲液进一步冲洗④再用20cv的0%～50%梯度洗脱液洗脱未结合的目标蛋白⑤根据CEX-HPLC检测结果,合并收集样液，流速为2.0ml/min收集蛋白峰⑥最后用3cv的再生水冲洗层析柱再生，然后用3cv的消毒液冲洗层析柱，再用3cv的注射用水淋洗层析柱，保存在2cv的20%乙醇。

生产过程条件说明如下

层析柱：

Axichrom450/550（即内径450mm,高度550mm）,床层体积为87.4L

填料：

POROS™50HS强阴离子交换树脂，货号为1255911，Gibco公司，其每毫升介质结合量为64～91mg,取64mg，即需要47L的填料。

层析系统：

AKTAprocess全自动可升级生产系统，型号AKTAprocess（GE公司）

操作系统：

unicorn系统（GE）

溶液：

平衡液：

2mmol/LTris-HCl，pH7.2

洗涤液：

20mmol/LTris-HCl，pH7.2

洗脱液：

20mmol/LTris-HCl+0～0.5mol/LNaCl，pH7.2

再生液：

2mol/LNaCl

消毒液：

50mmol/LNaOH

2.阳离子交换层析

阳离子交换层析是对抗体液进行深度纯化,去除不需要的阳离子。

在目的蛋白峰出来前立即换成低pH值的平衡液，从而在保证回收率的前提下去除大部分酸性杂质。

层析温度18~26℃,层析时间约2h,层析过程需要加入一定量的缓冲液,层析后有不需要的缓冲废液L5产生。

具体步骤如下：

①将强阳离子交换树脂填充于层析柱②用5cv平衡液清洗层析柱后上样，样品在柱上保留4min③用3cv平衡液淋洗至A280基线⑤再由1倍柱体积的洗涤液进一步冲洗，之后立即用3cv的平衡溶液洗涤层析柱④再用洗脱液洗脱5cv⑥根据CEX-HPLC检测结果,合并收集样液，流速为2.0ml/min收集蛋白峰⑦最后用3倍柱体积的再生水冲洗层析柱再生，然后用3倍柱体积的消毒液冲洗层析柱，再用3cv的注射用水淋洗层析柱，保存在2cv的20%乙醇。

生产过程条件说明如下

层析柱：

Axichrom450/550（即内径450mm,高度550mm）,床层体积为87.4L

填料：

POROS™50HS强阳离子交换树脂，货号为1335911，Gibco公司，其每毫升介质结合量为57.0-75.3mg,取57mg，即需要53L的填料。

层析系统：

AKTAprocess全自动可升级生产系统，型号AKTAprocess（GE公司）

操作系统：

unicorn系统（GE）

溶液

平衡液：

20mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH5.4

洗涤液：

10mmol/LTris-HCl，pH7.8

洗脱液：

50mmol/LTris-HCl，pH8.2

再生液：

2mol/LNaCl

消毒液：

50mmol/LNaOH

2.2.1.10病毒过滤

为了避免纯化中外源性病毒引起单抗活性降低。

这里采用纳滤方法进行病毒过滤，由GE公司提供DK8040F30型号的纳滤膜。

pH值在7.2~7.3范围,操作温度25~28℃,过滤时间约2～3h,滤膜冲洗过程中会产生冲洗废液L6。

2.2.1.11超滤浓缩

病毒过滤后原液进行浓缩,将可能含有缓冲液等除去,提高原液中有效成分浓度。

pH值在7.2~7.3范围,操作温度25~28℃,超滤时间约2～3h,超滤介质每次使用后需冲洗，清洗中会产生废液L7。

超滤所用膜包（由默克公司提供，型号MC0HC10FS1）孔径选自30kD超滤膜。

2.2.1.12原液收获

为了避免微生物污染，单抗原液品生产的全过程要进行微生物控制，以达到无菌目的。

除菌过滤器通过利用截留和吸附性截留的方法将液体或空气的细菌除去，过滤器在使用中需要利用一定量的注射用水进行冲洗,产生冲洗废液L8。

2.2.2药物制剂（DP）

药物制剂（DP）生产工艺是从制剂到成品存。

原液经配料加入一定量的注射用水及缓冲液,经化验合格得到合格药液,在灌装机半加塞后送冷冻干燥机,箱体内冷冻干燥,水分合格后在冻干机内压盖,出冻干机后轧铝盖得成品,灯检合格的产品进入外包装间,在贴签机上贴签、装盒、装箱送仓库低温储存。

待检合格后出厂。

2.2.2.1制剂配料

在除菌过滤后的抗体液加入相应的制剂配方配制成的原液即为成品原液,经过有效成分检验合格即可进行包装,过程中有极少量的检验液成为废液L9。

表2.1贝伐珠单抗注射液制剂配方

成分

浓度

贝伐珠单抗

100mg

α，α-双羧海藻糖

5.3mg

磷酸钠

1.3mg

聚山梨酯20

4.0mg

稀盐酸（1%）

0.4ml

注射用水

加水至4ml

2.2.2.2灌装

购买的包装容器利用注射用水清洗,产生废液L10,然后采用灌装机进行灌装。

2.2.2.3冻干

将完成上一步流程的产品送入冻干机冷冻干燥,冻干的任务后清洗,产生废液L11。

2.2.2.4压盖

将无菌的盖子装入压盖机进料斗，压盖机必须有冻干机的卸载过程同步。

2.2.2.5成品检查

每批次通过统计抽样检查，确保西林瓶的完整性。

2.2.2.6包装

所有包装材料前都要适应至环境温度，以免操作过程发生冷凝现象。

2.2.2.7储存

包装完后，托盘将被拉伸包裹并转移至仓库冷冻间储存，直到质控完成后放。

3工艺计算

3.1生产周期

具体见下表

表3.1工艺流程主要操作与生产周期

序号

产品名称

主线操作

生产时间

每周生产批次

1

DS

种子复苏、细胞接种与扩增

24h

2000L发酵罐培养到无菌过滤为17.8d~23.8d，其余生产过程可交替进行

2

上游细胞培养

21~26d

3

离心过滤

2~3h

4

蛋白捕获

2~3h

5

病毒灭活

2~3h

6

下游纯化与无菌过滤

2~3d

小计

24.3~30.4d

1

制剂配料

3h

每批生产时间2.8d，两批间间隔19d

2

DP

灌装

6h

3

冻干

24h

4

压盖

7h

5

检查

24h

6

包装

2h

小计

2.8d

3.2贝伐珠单抗原液基础数据及工艺指标

参照《中华人民共和国劳动法》规定，设计生产天数300天，生产周期为17.8d~23.8d,取中间值20.8d，故年生产批次为14个。

（1）生产天数300天

（2）产品批产量1500L×98%×2g/L=2940g

（3）产品年产量2940×14=41160g

（4）发酵周期20.8d

（5）倒罐率2%

（6）发酵罐装液系数：

75%

3.3贝伐单抗原液车间的物料衡算

1.2000L发酵罐发酵液量

2000L×75%=1500L

式中75%——酵罐装液系数

其中在2000L发酵罐培养过程中，需要加入的基础培养基的量为1010L，由200L种子罐接种到发酵罐的量为40L，第2d、4d、6d