HhBmp和RA信号之间相互拮抗控制斑马鱼内分泌胰腺的发育翻译.docx

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HhBmp和RA信号之间相互拮抗控制斑马鱼内分泌胰腺的发育翻译

Antagonisticinteractionsofhedgehog,Bmpandretinoicacidsignalscontrolzebrafishendocrinepancreasdevelopment

Hh，Bmp和RA信号之间相互拮抗控制斑马鱼内分泌胰腺的发育

ZahraTehraniandShuoLin*

翻译：

Alex21（CollegeofLifeScience,SichuanUniversity）

概要

胰腺器官的形成过程被数种信号所调控。

在脊椎动物的早期胚胎发育中，抑制内胚层Hh信号的活性是胰腺特化的先决条件。

然而对于斑马鱼来说，Hh的减少将会导致β细胞的急剧减少，从而进一步引起一些不明确的如Hh在胰腺发育过程中那样的作用，无论Hh的功能在不同的物种之间是否出现了偏离。

在此，我们运用基因学以及药理学的手段来对Hh在斑马鱼内分泌胰腺的发育中所扮演的角色以及Bmp和RA信号之间相互作用的关系进行研究。

我们发现Hh在原肠胚形成开始的时候是必不可少的，它对于细胞向内迁移起作用；同时在后一个阶段pdx1表达分化出胰腺前体细胞过程中Hh也是必须的。

在早期扮演一个积极角色的Hh能够藉由抑制Bmp的效果从而促进β细胞分化。

早期的原肠胚时期抑制Bmp信号便会导致β细胞数量的增加，而且在部分Hh缺乏的胚胎中还能够恢复使得β细胞形成。

在原肠胚形成的末期，Hh则转变为一个消极的角色，它能够反作用于由RA介导的内分泌胰腺特化过程，在接下来的过程中却促进内分泌胰腺的分化。

我们将展示在内胚层移植过程中RA抑制Hh信号成分ptc1和smo的过程，这表明在内胚层前胰的特化阶段可能存在一种阻塞轴旁中胚层衍生的Hh配体的分子机制。

这些结果确定了Hh在胰腺的发育过程中扮演着连续的多重的角色，并且这些结果显示出一个出乎预料的有关于Hh与其他控制胰腺特化分化的信号相互拮抗的关系。

关键词

斑马鱼内分泌胰腺BmpHhRAPdx1胰岛素β细胞内胚层

介绍

胰腺是由内胚层发育而来，内胚层在早期的脊椎动物的原肠胚形成过程中由一些呈平板状排列能够产生多种功能的前体细胞组成。

一系列来源于周围中胚层组织在进化上保守的外源信号通过抑制或者促进内胚层细胞中不同的转录因子网路从而对胰腺的特化和分化进行协调。

其中许多信号和转录因子已经被鉴定出来并且能够很好的作为包括斑马鱼在内的各种脊椎动物模式系统的特性。

然而，关于这些信号活动过程的时间程序以及他们之间如何相互作用从而控制胰腺发育的机制还不是很清楚。

新胰腺组织特化的最早期以及最特别的标志是胰腺和十二指肠同源异型框1（pdx1）的表达，pdx1稍后的过程中会限制β细胞族以及十二指肠（Biemaretal.,2001;Guzetal.,1995）。

Pdx1+细胞代表了一个能够产生多种功能的前体细胞群体，这些细胞能够形成所有胰腺细胞类型，包括胰岛细胞，腺泡细胞以及导管细胞（Guetal.,2002）。

Pdx1功能的缺失将会造成胰腺发育不全（Huangetal.,2001a;Jonssonetal.,1994;Offieldetal.,1996;Yeeetal.,2001）。

在羊膜的胚胎发育时期，分泌蛋白脊椎动物中Hh家族的两个成员Shh和Ihh会在早期的内胚层上皮组织中高水平表达，同时会在前肠——注定要变成胰腺的部位显著减少，这取代了Pdx1的高水平表达。

（Apelqvistetal.,1997;Hebroketal.,1998;Ramalho-Santosetal.,2000）。

在小鼠以及家鸡的研究中确立了脊索相关信号局部抑制Shh的表达——Pdx1表达诱导所必须的一个步骤（Hebroketal.,1998;Kimetal.,2000;Kimetal.,1997）。

Shh和Ihh以一种相似的方式结合到Ptc1（Ptch1）受体上（Carpenteretal.,1998），上述蛋白在胰腺原基中同样不表达（Apelqvistetal.,1997）。

Hh配体与Ptc1的结合能够缓和Ptc1介导的Hh信号转物Smo，从而允许Smo启动Hh信号的级联反应。

Shh在小鼠、家鸡以及增加了Hh信号的Ptc1–/–小鼠发育过程中胰腺内胚层的表达能够取消Pdx1的表达（Apelqvistetal.,1997;Hebroketal.,1998;Hebroketal.,2000;Kawahiraetal.,2003;Kimetal.,2000）。

相反地，运用Smo的拮抗物环巴胺对家鸡早期胚胎的Hh信号进行全面抑制能够产生特别的胰腺芽，这种胰腺芽具有已分化的内分泌细胞，并且能够促使肠和胃上生成异位胰腺（KimandMelton,1998）。

此外，hh–/–;Ihh+/–小鼠胚胎表现出胰腺尺寸的变大以及内分泌细胞数量的增加（Hebroketal.,2000）。

总而言之，这些观察结果引导向了一个模式：

在羊膜动物中，Hh信号具有中断胰腺特化的作用，并且在内胚层胰腺前体处对Hh活性的有效抑制还是启动胰腺发育开始的一个关键步骤。

然而，类似的观察结果还未能在其他的脊椎动物的实验中得到。

虽然从鱼类到哺乳动物其胰腺的基本结构和功能是保守的，但在斑马鱼关于胰腺的形态的过程中还是有小而显著的差别。

尤其是，哺乳动物的胰腺是由原肠管上两个显著的区域特化而来，这两个区域在随后的过程中外翻形成背腹部的胰腺芽（Murtaugh,2007）。

相比之下，在斑马鱼中，胰腺前体在10体节处[受精后14小时（hpf）]开始出现，并且此过程发生在两侧有成行排列的pdx1细胞的肠管形成之前。

那些处于最中间的细胞小群体高水平的表达pdx1，将来会分化成背部内分泌细胞芽，这其中包括表达胰岛素的β细胞（15hpf）。

当两片的内胚层板开始聚集的时候，Pdx1+和insulin+细胞随之平均地移动（16hpf）。

在24hpf时，内分泌细胞在中线出合并并且变成背部的胰腺芽。

在40hpf时，低水平表达pdx1的细胞形成肠原基的前体和腹部的胰腺芽，这样就在胚胎发育的后一个阶段产生了外分泌细胞以及额外的一些内分泌细胞（Fieldetal.,2003）。

和羊膜动物一样，在斑马鱼的整个发育过程中，shh的表达始终不出现在胰腺内胚层中（Royetal.,2001）；然而，斑马鱼shh和smo突变体几乎全部缺乏能够表达胰岛素、胰高血糖素、nkx2.2和neurod（diIorioetal.,2002）。

此外，在早期原肠胚形成时在胚胎中添加环巴胺能够导致胰岛素表达量的急剧下降，但是如果在原肠胚形成之后进行如上步骤则会造成先于正常胰岛形成的一种胰岛素表达细胞异位成倍聚集的现象（diIorioetal.,2002）。

这些发现暗示出Hh信号在鱼类和哺乳类动物胰腺发育过程中有着相反的功能。

为了解释这样的差异，有人提出对Hh的应答随时发生变化用以调整胰腺发育的不同方面。

（Hebroketal.,2000）；然而，这个说法在生物体中还未被彻底的证实。

除了Hh信号通路以外，RA信号通路在胰腺形成过程中同样是一个重要的调节因子；虽然，我们还不清楚它们两者在此过程中是如何相互作用的。

维他命A的衍生物RA在胚胎发育的前后轴图示形成过程中总的充当一个中介者（Duester,2008）。

在斑马鱼中，在原肠胚形成晚期期对RA通路的抑制将会造成内胚层结构上严重的缺漏，这包括胰腺特化的完全缺失。

此外，在相同阶段RA的异位表达造成一个具有胰腺特征的呈浓度依赖性的喙形膨胀物取代先前的内胚层结构，这意味着RA不仅仅能够特化胰腺而且能够调节胰腺在内胚层前后轴上的位置（StaffordandPrince,2002）。

类似的对RA的需求在小鼠中同样被发现（Martinetal.,2005;Molotkovetal.,2005），青蛙和蟾蜍的胚胎则证明被RA信号所调控的作用于胰腺特化的遗传程序在脊椎动物中是充分保守的。

在早期的原肠胚时期背腹轴上的Bmp活性梯度和后一阶段前后轴上的区域划分有关系（Tisoetal.,2002）。

在体节发生过程中侧板中胚层中的Bmp信号能够促进肝脏形成于此同时抑制胰腺形成（Chungetal.,2008）。

然而，对于Bmp图式信号如何有效使得胰腺β细胞特化我们知道的很少。

在早期原肠胚时期，背部组织者（胚盾）和据推测的环绕其的背部中胚层分泌出Bmp的抑制剂（Dal-Praetal.,2006），这喻示着在Bmp和Hh信号通路之间可能存在着一种相互作用，因为Shh配体也是为胚盾所分泌的。

在这次的研究中，我们尝试去确定某时期Hh信号所扮演的角色并且研究在斑马鱼的内分泌胰腺形成过程中它和RA以及Bmp信号通路之间的关系。

我们利用斑马鱼胚胎外观发育迅速的优点，并且在胚胎形成的不同阶段利用一些小分子来对信号通路的活性进行短时间的操控。

我们发现在早期的原肠胚形成时期，Hh对于胰腺前体细胞分化和迁移形成背部由芽所派生的β细胞以及发育后一阶段的外分泌细胞是必不可少的。

在原肠胚晚期，Hh转变为一个消极的角色，它反作用于由RA介导的内分泌胰腺的分化，从而首次揭示哺乳动物胰腺特化过程中的Hh的抑制功能在斑马鱼中是同样保守的。

最后，我们通过演示在Hh信号缺陷的胚胎中原肠胚时期对Bmp信号进行抑制能够部分挽救背部由芽衍生的β细胞的形成从而发现了在Hh和Bmp通路之间存在一种拮抗作用。

这些发现将至关重要的分子机制补充到了胰腺特化以及β细胞系分化过程中。

实验方法和材料

斑马鱼种

在接下来的试验中所使用的突变体以及转基因材料都是smohi1640（Chenetal.,2004），sdr1a590（smo1a590）（Kimetal.,006），Tg（ins:

GFP）（Huangetal.,2001b），Tg（hsp70l:

dnBmpr-GFP）w30（Pyatietal.,2005）和Tg（flk1:

GFP）（Crossetal.,2003）。

Tg（pdx1:

GFP）鱼（详见补充材料Fig.S1）携带有gata2最小的GFP启动子结构并且插入了6kb的斑马鱼pdx1转录起始位点上游片段，是由我们内部的基于Tol2的增强子陷阱筛选（我们尚未公布的数据）。

野生型胚胎则来源于AB型。

化学处理

胚胎是在以下条件下培养的：

25μM环巴胺（Biomol）溶于10mM乙醇（乙醇在稀释至工作浓度之前需预热到28-30℃）；purmorphamine（CaymanChemical）经过10mMDMSO处理；1μM全反式RA（Sigma-Aldrich）经过5mMDMSO处理；15μMdorsomorphin（Sigma-Aldrich）经过5mMDMSO处理；5μMSU5416（Sigma-Aldrich）经过0.5mMDMSO处理。

对照组用等体积的酒精处理。

所有的稀释液都使用养鱼水。

使用时加入4-5ml体积至6槽培养板，每槽培养40-50个胚胎。

使用养鱼水持续15-20min冲洗以停止短时间处理。

每一个实验至少进行两个独立的化学处理过程。

热击条件

来自于半合子Tg（hsp70l:

dnBmpr-GFP）w30异型杂交后代的胚胎于2hpf开始经由25µM环巴胺进行处理并且在6hpf时通过将他们转移到胚胎中部，包括已经预热至38.5℃的环巴胺。

热机过程在38.5℃水浴中进行一个小时然后将胚胎转移至28.5℃孵化。

在热机过后3-4小时时胚胎根据GFP表达进行排序并且一直孵育直到定影为止。

原位杂交

原位杂交（ISH）操作过程略（ThisseandThisse,2008）。

使用如下探针：

cpa2,hhex,hnf1ba,insulin（preproinsulin–ZebrafishInformationNetwork）,pdx1和ptf1a。

定量PCR

RNA模板分离自三联体。

对于每一份样品，全部的RNA使用TRIzol（Invitrogen）提取自一批30个胚胎。

cDNA将使用SuperScriptIIKit（Invitrogen）。

qPCR以三联体在iCycler（Bio-Rad）with1×iQSYBRGreenSupermix（Bio-Rad）的形式进行。

PCR的引物（Sigma）如下（5＇-3＇）：

β-actin、CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT（F）,CACCGATCCAGACGGAGTAT（R）;pdx1,GGACCAGCCAAATC-TTACCG（F）,CCTCGGCCTCGACCATATA（R）;ptc1,GTTACTGC-CACGCCGCTTTTG（F）,CTGACTCCTCTCCTTGCTTCT（R）;smo,TGAAGACTCAGAAACTCAAGA（F）,GACCAACGGAGCCTCGC-ATT（R）;insulin,CTCTGTTGGTCCTGTTGGTC（F）,CTCAAAGATG-CTGCAGGGT（R）。

呈出的数据是由至少两个独立的实验得出的三联体的平均值……

mRNA合成以及内胚层移植

大约400pg的sox32mRNA（T7mMessagemMachineKit,Ambion）加入到Tg（ins:

GFP）1-细胞期的胚胎中。

胚胎处于high和球状阶段之间时在25-29℃热室中被手工去除卵黄和卵膜。

大约25-30内胚层移植体置入共有96槽的平底培养板（Costar）的一个槽中。

每个槽中覆盖有1%UltraPure的琼脂糖（Invitrogen），移植体在1×ModifiedBarthSerum（MBS）上生长，过程略（Grinblatetal.,1999）。

移植体在MBS的1µMRA中28.5℃孵育过夜并且当未注射控制的胚胎达到24hpf时进行检查。

细胞计数

将24hpf的Tg（pdx1:

GFP）和Tg（ins:

GFP）胚胎解离，过程略（Westerfield,2000）。

使用快速成像软件（Improvision）以及40×waterobjective。

结果

在Hh-缺乏的胚胎中Pdx1的表达量增加

在先前的一个ENU诱变筛选得到影响胰腺发育突变体的试验中，我们分离得到seadragon（sdr1a590）突变体。

在24hpf时，sdr突变体显示出消弱的内分泌胰腺标记和一个扩大的双侧pdx1区域（Fig.1C,D）（Kimetal.,2006）。

我们标记了sdr1a590突变在smo基因上，这个基因能够编码一种Hh信号转导作用所必须的七次跨膜蛋白（RohatgiandScott,2007）。

对其进行测序发现sdr1a590突变体携带有一个从T到A的点突变，这导致了499残基上的一个异亮氨酸代替了原本的天冬氨酸。

Ile499在脊椎动物中是高度保守的，它定位于Smo的胞外第三个环上，正好与第七次跨膜区域毗邻。

从无极性的Ile变化为有极性的Asn有可能在Smo中造成了一种，据推断是G蛋白偶联受体（GPCR）（Ogdenetal.,2008）蛋白组成的改变，揭示出这个区域可能在影响Smo的活性中扮演着一个重要角色，一如其他GPCR家族成员上的同一区域。

（LawsonandWheatley,2004）。

对插入突变的smohi1640进行互补分析（Chenetal.,2001）证实sdr1a590是smo（在此之后被称为smo1a590）的另外一个等位基因。

在30hpf时，转移-杂合（smohi1640/smo1a590）胚胎表现出Hh信号缺乏的显性性状和与之相似的smohi1640无效等位基因，包括U-型体节，无循环，腹侧生长的弯曲的尾巴，以及大部分都完全缺乏的Hh目标基因nkx2.2a的表达（Chenetal.,2001;Vargaetal.,2001）。

在smo1a590和smohi1640突变体中对ptc1，一个Hh信号通路的目标基因以及一个已确定的Hh活性读出基因，进行qPCR，显示出一个相似的Hh活性减小的结果。

这就是说，smo1a590可能是一个无效的或者亚效的等位基因。

羊膜动物中的功能获得与缺失研究让我们能够确定Hh在胰腺特化过程中是作为一个消极的调节者。

而关于斑马鱼中是否存在一个与之相似的角色我们尚不确定因为在斑马鱼的Hh突变体中背部胰腺极度减少（Hebrok,2003;Royetal.,2001）。

我们首先使用qPCR检查了缺乏Hh信号的胚胎中Hh信号在从16.5到26hpf过程中不同的时间点对pdx1表达的影响。

由于26hpf之前smo1a590突变体不能够被明显的分辨出来，野生型的胚胎也经过Smo拮抗物环巴胺的处理（Cooperetal.,1998）来分析更早的时间点。

通过对Hh受体ptc1表达的分析已经证

Fig.1.Pdx1isincreasedinHh-deficientembryosby24hpf.（A-D）pdx1expressionat16.5hpf（A,B）and28hpf（C,D）inwild-type（A,C）,cyclopamine-treated（B）andsmo1a590mutant（D）zebrafishembryos.At16.5hpf,pdx1-expressingcells（whitearrowheads）beginconvergingatthemidline（A）,andby28hpftheyhavecoalescedintoasingleclustercorrespondingtothedorsalpancreaticbud（blackarrowhead）（C）.InHhsignaling-deficientembryos,thestripesofpdx1expressionareexpanded（D）andremainseparated（B,D）aspdx1-expressingcellsfailtoinitiatemedialmigration.（E,F）hnf1baexpressionintheforegut（arrows）at30hpfinsmo1a590mutants（F）versuswildtype（E）.（G,H）cpa2expressionintheexocrinepancreasat3dpfinsmo1a590mutantembryos（H）versuswildtype（G）.AllimagesinA-Haredorsalviews,anteriortotheleft.（I）qPCRofpdx1andptc1expressionlevelsatdifferentdevelopmentalstagesinembryoslackingHhsignaling（mean±s.e.m.）.Expressionofpdx1wasinitiallyreducedat16.5hpfbutsignificantlyelevatedat24hpfincyclopamine-treatedembryosascomparedwithuntreatedcontrolsandat26hpfinsmo1a590mutantsascomparedwithwild-typesiblings.Asterisksdenoteasignificantchangeversuscontrolbyatleasttwos.d.（J）Arepresentativeimageofdissociatedcellsfromacyclopamine-treatedTg（pdx1:

GFP）embryoat28hpf.（K）QuantificationofGFP+cellsinuntreated（wt）andcyclopamine-treated（cyc）Tg（pdx1:

GFP）embryosat28hpf.They-axisindicatesthenumberofGFP+cells.Allcyclopamine（25M）treatmentswereinitiatedat2hpfuntilharvest.

实在突变体以及环巴胺处理的胚胎中Hh活性减少。

在16.5hpf,Hh活性的降低导致pdx1转录水平平缓的降低，但是在24hpf以及从此往后的时间中，表达是~2倍高（Fig.1I）。

为了证实这样的观察结果并非我们的突变体独有的，我们同时还检查了smohi1640突变体并且发现在26hpf时pdx1表达有所增加（数据未显示）。

RNAISH在16.5hpf时通过揭示一个弥散的pdx1表达图示以及高水平表达细胞的缺乏确认了这些结果；此外，pdx1表达细胞迁移的开始显著的延迟了（Fig.1A,B,arrowheads）。

在26hpf,在smo1a590突变体中pdx1区域扩大并且保留了分离（Fig.1C,D,arrowheads），这个现象并不特别针对于胰腺（Fig.1G,H），整个前肠由于肠标记基因hnf1ba的表达是裂开的（Fig.1E,F,arrows）。

与此观察结果一致的是，我们发现相较于未处理的胚胎（272-22;n=4），用环巴胺处理过的胚胎（393-27;n=4）在1dpf时Tg（pdx1:

GFP）表达细胞数量有增加（Fig.1J,K）。

不出所料，在所有阶段胰岛素的表达缺乏或者彻底减少也被证实。

这些结果喻示着Hh信号对于限制pdx1表达前体细胞的数量很重要。

原肠胚形成晚期Hh信号的减少导致pdx1表达量的增加

Pdx1在背侧和腹侧的胰腺芽中都有表达，和在肠球茎中的情况一样（Fieldetal.,Fig.2.Effectsoftransientcyclopaminetreatmentonexocrineandendocrinepancreasdifferentiation.（A-P）Dorsalviews（anteriortotheleft）ofwild-typezebrafishembryostransientlytreatedwithcyclopamine（25M）either2-7hpf（B,F,J,N）or9-12hpf（D,H,L,P）versusuntreatedcontrols（A,E,I,MandC,G,K,O）andexaminedat24hpfforpdx1（A-D）andneurod（E-H）,at48hpfforptf1a（I-L）andat3dpfforcpa2（M-P）expression.Thenumberofembryosdisplayingsimilarexpressionpatternsisindi