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RNA电泳
實驗九RNA電泳
(ElectrophoresisofRNA)
概述
本實驗以agarose膠體分離大小不同之RNA分子。
Agarose乃D-galactose及3,6-anhydroL-galactose之聚合物。
一般agarose在室溫呈凝固狀態,而加熱80℃則溶解,故agarose膠體製備很容易,只需選擇使用之濃度,將agarose如熱溶解後倒入電泳槽中,形成所需要厚度之agarose膠體。
目前市面上也售有較低溫即可溶解的agarose,只需加熱至45-55℃。
agarose膠體孔隙的大小(poresize)決定於所使用的濃度,一般以0.6-1.5﹪agarose濃度之選擇請參考下表:
Agarose百分比(w/v) 核酸大小,核甘酸數目
0.6﹪ 1000-20000
0.8﹪ 600-8000
1.0﹪ 400-7000
1.2﹪ 300-6000
1.5﹪ 200-3000
Agarose膠體店用一般以5伏特/公分的電壓進行。
必要時可加裝冷卻水槽散熱。
為確知電泳進行狀況,RNA樣品內可加入BromophenolBlue及XyleneFF,Bromophenolblue移動速度較XyleneCyanolFF為快。
電泳進行至BromophenolBlue至XyleneCyanolFF移動至所需位置後停止,膠體以溴化乙錠(Ethidiumbromide;EtBr)染色。
當以紫外光照射膠體時,EtBr發射橘光,以此確知RNA存在。
當取細胞內全部的RNA進行電泳分析時,膠體上可清楚看到28S及18SrRNA。
因rRNA佔全部RNA之80-85﹪,故再膠體上此二rRNA清晰可見,也可以此判別分離之RNA是否完整或有斷裂。
一般18SrRNA為1.8-2.0kb,28SrRNA為4.6-5.2KB,BromophenolBlue之移動速度較18S或28SrRNA都快,XylenecyanolFF在1﹪agarose膠體電泳時期移動較18SrRNA稍慢。
28SrRNA之量約為18SrRNA之2倍。
EtBr是一種很強的突變劑(Mutagen),使用時必須非常小心,必須帶手套操作。
EtBr以10mg/ml之濃度於4℃存放。
其外需以鋁箔紙包住以避光,其使用濃度則不超過0.5μg/ml。
EtBr可在膠體形成前就加入以溶解之agarose中,但須注意agarose溫度需降至60℃以下方可加入EtBr。
若膠體內含EtBr,則RNA進行電泳過程中可照紫外光看到RNA之移動情況,但電泳時亦須在緩衝液中加入EtBr。
EtBr需特別處理後方可丟棄。
將EtBr廢棄液之濃度調至低於0.5μgEtBr/ml,而後沒100mlEtBr廢棄液加入100mg粉未撞之活性碳(activatedcharcoal)。
於室溫放置1小時,偶而混合一下,再以WhatmanNO.1濾紙過濾,丟棄過濾液。
濾紙連同其上之活性碳一下,放入塑膠袋中,集中送至廢污即有害物質處理工廠。
試劑/器具
名 稱
規 格
數 量
瓊指糖膠(Agarose)
1瓶
溴乙錠Ethidiumbromide
10mg/ml
1瓶
自大腸桿菌抽取之RNA樣品
甲醛
1瓶
MOPS
1瓶
Sodiumacetate
1瓶
EDTA
1瓶
Bromophenolblue
1瓶
Xylenecyanol
1瓶
Glycerol
1瓶
瓊指糖膠 溴乙錠
RNA樣品 甲醛
MOPS Sodiumacetate
EDTA Bromophenolblu
Xylenecyanol Glycerol
儀器/設備
名 稱
規 格
數 量
水平迷你凝膠電泳系統
1套
小離心機
1台
微波爐或酒精燈
1台
軟片架
1組
乾浴器
1台
電泳影像分析處理系統(ImageMasterVDS)
1台
冷凍乾燥機
1台
水平迷你凝膠電泳系統 小離心機
微波爐 軟片架
乾浴器 電泳影像分析處理系統
冷凍乾燥機
步驟
水平agarose膠體備製及電泳步驟
取水平電泳槽之塑膠盤,以膠帶封好周圍,並水平放置於桌面上。
↓
於comb於塑膠盤中,聚盤底部0.5-1.0mm。
配製1﹪agarose及製作agarose膠體。
取1gagarose,加60ml之DEPC-H2O,以微波爐加熱15秒,或以沸水浴加熱,使agarose溶解。
↓
帶溫度降至60℃後加入20ml之12.3Mformaldehyde及20ml之5XMOPS緩衝液,混合均勻後倒入準備好之塑膠盤內。
↓
Agarose溶液蹈入速度要快,避免agarose溶液倒入之前以凝固。
膠體厚度約3-5mm,以6*10cm之膠體而言,約需20-30mlAgarose溶液。
需注意膠體中無氣泡,尤其是comb底部。
↓
30-45分鐘後,agarose膠體形成完全,小心移去comb及膠體周圍之膠體放入電泳槽。
RNA樣品處理
取50μgRNA,以75﹪酒精沈澱。
↓
以speedvaccum抽乾RNA沈澱。
↓
取出4支1.5ml微量離心管,分別標示#1~#4,依序加入下列各項試劑。
#1
#2
#3
#4
RNAfromE.coli
RNAfrominvitroTxn
-IPTG
+IPTG
-DNase
+DNase
dH2O/DEPC
4.5-X
4.5-X
2.5
2.5
RNA
X(6μg)
X(6μg)
5
5
5Xform.running
2
2
2
2
Formaldehyde
3.5
3.5
3.5
3.5
Formamide
10
10
10
10
Totalvolume
20
20
20
20
↓
將四管混合均勻後,置於65℃反應15分鐘。
↓
置於冰浴中,各管分別加入2lformaldehydegel-loadingbuffer。
↓
膠體先以5伏特/公分進行5分鐘後,再加RAN樣品於膠體樣品槽中。
同樣以5伏特/公分進行電泳。
↓
以6*10CM膠體而言,可以50伏特進行電泳],則+極-極都可見氣泡產生。
電泳進行至第一個染劑(bromophenolblue)移動至膠體末端方停止。
↓
↓
以DEPC-H2O淨泡除去膠體上多餘的EtBr,EtBr廢亦需特別處理不可任意丟棄。
↓
以紫外光照射膠體,可清楚看見18S及28SrRNA。
可照相劑入實驗結果。
若不見18S極28SrRNA,則RNA可能在分離過程中斷成小的RNA片段或被RNAase分解了。
討論
1. 分離所得RNA之OD260/OD280之比值與電泳分析結果之關聯性。
2. EtBr為何會使DNA呈色?
使用上及廢棄時需注意哪些事項?
3. 為何agarose膠體電泳以水平方式進行?
參考文獻
1. Sambrook,J,Fritsch,E.F.andManiatis,T.(2ndedition)MolecularCloning.ALaboratoryManual.pp.3-6.48.ColdSpringHarbor,1898.
2. Farrell,R.E.J.,rRNAMethodologies.ALabaratoryGuideForIsolationn andCharacterization.pp.113-124.AcademicPress,1993
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