05第六章离子交换层析pptConvertor.docx
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第五章离子交换层析
离子交换层析
在以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行。
第一节基本原理
离子交换剂:
由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成(见图5-1)。
在水中呈不溶解状态,能释放出反离子。
在此同时,它将与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合,结合后本身的理化性质仍保持不变。
纤维素
O
CH2
COO—
Na+
基质
电荷基团
反离子
图5-1羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应:
主要以离子交换方式进行,或者,离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
假设以RA代表阳离子交换剂,它在溶液中解离出来的阳子A+与溶液中的阳离子B+能发生可逆的交换反应,反应式如下:
RA+B+=RB+A+
离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力,
这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。
离子交换的选择性可用其反应的平衡常数KBA表示:
KBA=[RB][A+]/[RA][B+]
如果在反应溶液中[A+]的摩尔浓度与[B+]的相等时,则KBA=[RB]/[RA]。
若KBA值>1,即[RB]>[RA],这表示离子交换剂对B+的结合力要比对A+的大;
若KBA值=1,即[RB]=[RA],这表示其对B+和A+的结合力相同;
若KBA值<1,[RB]<[RA],表示其对B+的结合力要比对A+的小。
KBA值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性的参数,所以称KBA值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。
从Bio-Rad公司1986年提供的资料(见表5-1)看出:
强酸性(阳性)离子换剂对H+的结合力比对Na+的小;
弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大;
强碱性(阴性)离子交换剂对OH-的结合力比对C1-的小得多;
弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。
因此,在应用离子交换剂时,采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。
离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力是:
与离子的电荷量成正比,而与水合离子半径的平方成反比。
所以,离子价数越高,结合力越大。
在离子间电荷相同时,则离子的原子序数越高,水合离子半径越小,结合力亦越大。
因此在稀溶液中离子发生水化时,各种阴离子和阳离子结合力大小的排列次序如下:
一价离子:
Li+ 二价离子: Mg2+ 一价阴离子: F- 不同价阳离子: Na+ 对于呈两性离子的物质(如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等)与离子交换剂的结合力,主要取决于: 它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。 当pH低于等电点(pI)时,它们能被阳离子交换剂吸附; 反之,pH高于pI时,它们能被阴离子交换剂吸附。 若在相同的pH条件下,且pI>pH时,pI越高,碱性越强就越容易被阳离子交换剂吸附。 图5-2是反映样品液在阳离子交换层析柱上分离情况的示意图。 根据图示理解用离子交换剂分离不同物质的基本原理。 第二节离子交换剂的分类及性质 实用的离子交换剂应满足下列要求: ①有高度的不溶性,即在各种溶剂中进行交换时,交换剂不发生溶解; ②有疏松的多孔结构或巨大的表面积,使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换; ③有较多的交换基团; ④有稳定的物理化学性质,在使用过程中,交换剂不能因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。 一、分类 根据离子交换剂中基质的组成和性质,可将其分成两大类: 疏水性离子交换剂 亲水性离子交换剂 1.疏水性离子交换剂 疏水性离子交换剂中的基质是一种人工合成的、与水结合力较小的树脂物质。 常用的一类树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物,其中二乙烯苯是交联剂,它能把聚乙烯苯直链化合物以相互交叉的方式连接成类似海绵状的结构。 在此结构中以共价键方式引入不同的电荷基团。 这种离子交换树脂以电荷基团的性质分类有: 阳离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团) 阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团) 螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性) (1)阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电,反离子带正电。 因此,这种交换剂可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。 根据电荷基团的强弱,又可将阳离子交换剂分为三种: 强酸型 带磺酸基团的树脂,可简写为R-SO3H,R代表树脂 中强酸型 带磷酸基团和亚磷酸基团的树脂,前者可简写为R-PO3H2,后者可简写为R-POH2 弱酸型 带羧基的和酚基的树脂,前者可简写为R-COOH,后者可简写为R-苯环-OH (2)阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入 季胺[-N(CH3)3]、叔胺[-N(CH3)2]、 仲胺[-NHCH3]、伯胺[-NH2]基团后构成的。 当引入季胺和叔胺基团时,分别为强阴性和中强阴性离子交换剂, 当引入仲胺和伯胺基团时,为弱阴性离子交换剂。 它们与溶液中的离子进行交换时,反应式为: R—N+(CH3)3OH-+C1-R—N+(CH3)3Cl-+OH- R—N+(CH3)2+H2OR—N+(CH3)2H·OH- R—N+(CH3)2H·OH-+Cl-R—N+(CH3)2H·Cl+OH- 主要用于: 分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质。 其次: 可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如十二烷基硫酸钠、TritonX-100)、尿素和两性电解质(ampholyte)。 此外,还可用于分离某些不易变性的蛋白质。 2.亲水性离子交换剂 亲水性离子交换剂中的基质是一类天然的或人工合成的、与水结合力较大的物质。 常用的有纤维素、交联纤维素、交联葡聚糖和交联琼脂糖等。 (1)纤维素离子交换剂 纤维素离子交换剂是以微晶纤维素为基质,通过化学方法引入电荷基团构成的。 这类离子交换剂按引入电荷基团的性质可分为: 强酸性、弱酸性、强碱性和弱碱性离子交换剂。 (2)交联葡聚糖离子交换剂 交联葡聚糖离子交换剂: 是以交联葡聚糖G-25和G-50为基质,通过化学方法引入电荷基团制成的。 常见的交联葡聚糖阳性和阴性交换剂有8种,见表5-5。 这类交换剂的外形呈珠状,对蛋白质和核酸等大分子物质有较高的结合容量(见表5,6),而且流速比无定形纤维素离子交换剂快。 (3)琼脂糖离子交换剂 琼脂糖离子交换剂: 主要是以交联琼脂糖CL-6B(SepharoseCL-6B)等为基质,通过化学方法引入电荷基团制成的。 例如, DEAE-SepharoseCL-6B为阴离子交换剂; CM-SepharoseCL-6B为阳离子交换剂等(见表5-6)。 这类离子交换剂的外形呈珠状,网孔大,特别适合分离大分子质量的蛋白质和核酸等物质,即使在流速快的操作下,也不影响分辨率。 二、性质 1.颜色与形状 树脂类离子交换剂的颜色种类很多,有褐色、黄色和乳白色等。 亲水性离子交换剂的颜色则基本上都是白色的。 市售的离子交换剂的外形绝大部分是珠状的,这有利于提高柱层析的分辨率。 2.交联度 离子交换剂中的基质都是通过交联剂交联而制成的固体物质。 这种基质比较稳定,不溶于水和其他普通溶剂,机械性能好。 不同离子交换剂中交联剂类型是不同的,如: 树脂的交联剂有: 二乙烯苯等; 交联葡聚糖和纤维素基质中的交联剂为: 3-氯代-1,2-环氧丙烷; 琼脂糖基质中的交联剂为: 2,3-二溴丙醇。 每种交联剂在基质中占的百分数(即交联度)是不相同的,例如,树脂中的交联度范围在2%~16%之间。 3.吸水量或膨胀度 离子交换剂在溶液中充分膨胀后, 它所带的电荷基团能得到充分的暴露, 网孔大小达到稳定状态, 这对提高交换容量和分辨率是有益的。 它们与基质、电荷基团的性质、溶液的pH值、离子强度是密切相关的: (1)基质 由亲水性基质构成的离子交换剂的膨胀度可以达到60ml/g干胶, 由疏水性基质构成的离子交换剂膨胀度较小。 不论哪一类离子交换剂,其膨胀度变化都是随着交联度的增加而降低的(见图5-3)。 (2)电荷基团 离子交换剂之电荷基团的电荷强弱,对其膨胀度影响是极为明显的。 强碱型离子交换剂的膨胀度比弱碱型离子交换剂的大; 当离子交换剂中电荷基团的电荷量一致时,不论带正电荷,还是带负电荷,其膨胀度是基本相同的(见图5-3的A、C或B、D) (3)溶液的离子强度和pH 当离子交换剂带有同种电荷或解离度最大时,各电荷基团之间的排斥力为最大,其膨胀度亦最大。 因此,交联度小的离子交换剂处于低离子强度时,其膨胀度比处于高离子强度时大。 但是,交联度大的离子交换剂的膨胀度几乎与离子强度的变化无关。 此外,弱离子交换剂在接近其pK值(电离常数)之pH(pH=pK-lg[酸]/[盐])溶液中膨胀度最小(因: 电荷机团的解离度最小)。 弱阳离子交换剂的膨胀度是随着pH值的提高而增大;(电荷基团的解离度增加) 弱阴离子交换剂的膨胀度却是随着pH值的降低而增大的(见图5-4)。 (电荷基团的解离度增加) 但是,交联度大的或带强电荷基团的离子交换剂,其膨胀度基本与pH值变化无关。 离子交换剂在溶液中充分膨胀后,对提高交换容量和分辨率是有益的 见图5-5。 4.交换容量 交换容量: 是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。 一般用总交换容量和有效交换容量表示。 总交换容量和有效交换容量除与离子交换剂本身的性质有关外,总交换容量并不受测定条件的影响,而有效交换容量却与测定条件有关。 (1)影响交换容量的因子 ①筛孔 有效交换容量与离子交换剂筛孔的直径以及分离物的分子质量大小密切相关。 当离子交换剂的交联度较低,并预先进行充分溶胀时,其筛孔会增大。 可使大分子物质进入筛孔与交换剂的电荷基团进行交换, 并且,暴露出来的电荷基团增加了离子交换。 ②离子强度 当溶液中的离子强度增大时,离子对交换剂上的束缚位点就会增加竞争作用,从而降低了交换剂的有效交换容量。 实践中,使用增大流动相离子强度,来洗脱束缚在交换剂上有效成分。 ③pH值 交换容量与电荷基团的数量,或者说与溶液的pH值有密切关系。 图5-6是几种离子交换剂的滴定曲线。 从曲线看出: 弱阴离子交换剂的交换容量: 是随着pH值(<其pK值)的下降(电荷基团的解离度增加)而增大的; 弱阳离子交换剂的交换容量: 是随着pH值(>其pK值)的上升(电荷基团的解离度增加)而增大的。 但是,带有强电荷基团的离子交换剂由于在任何pH值的溶液中都处于解离状态,所以交换容量基本与pH值变化无关。 5.稳定性 离子交换剂都具有理化稳定性。 特别是树脂类离子交换剂,在浓度较高的酸或碱溶液中进行短期处理后,其性质仍无改变。 而亲水性离子交换剂的理化稳定性,一般与其基质的稳定性相近,即在水、盐、碱、弱酸和有机溶剂等溶液中是稳定的。 而且经交联引进离子基团之后,稳定性还会有所提高。 6.比重 离子交换剂经过溶胀处理后的比重是恒定的。 但是,在不同溶液中溶胀处理后的比重是有差异的。 因此,在装柱之前,对于经过蒸馏水溶胀、酸或碱溶液处理的离子交换剂,一定要在平衡溶液中进行充分的平衡,否则在装柱时将可能产生上浮现象。 7.流速 流速一般是由离子交换剂的性质、操作压、层析柱体积和分离样品的要求等因子控制的。 适当的流速可以提高层析的分离效果(见图5-8)。 用琼脂糖离子交换剂层析时,采用较快的流速,对分辨率影响不大。 因此,在大量分离生物样品时,可以选用这种离子交换剂。 流速大小常用如下单位表示: 体积流速(ml/h或ml/cm2·h) 线性流速(cm/h) 在操作压和其他层析条件相同的情况下: 离子交换剂的颗粒大,流速就快,反之则流速慢; 洗脱液的黏度大,流速就慢,反之则流速快。 当机械强度大的树脂、琼脂糖或交联度大的葡聚糖等离子交换剂用于层析时,其流速与操作压基本呈线性关系(见图5-7)。 而当交联度小的葡聚糖离子交换剂用于层析时,其流速与操作压则呈抛物线关系(见图5-7)。 层析柱的长度和截面积与流速也有关系: 用长的或截面积大的层析柱时,其流速的增加是随操作压(一定范围内)的增大而增加的。 第三节离子交换剂与缓冲液的选择 一、离子交换剂的选择 任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品物质。 选择理想的离子交换剂以提高有效成分之得率和分辨率。 1.阴、阳离子交换剂的选择 实践中究竟是选择阴离子交换剂,还是选择阳离子交换剂? 这取决于被分离物质所带的电荷: 如果被分离物质带正电荷,则应选择阳离子交换剂; 如果被分离物质带负电荷,则应选择阴离子交换剂; 如果被分离物质为两性离子,则一般应根据其在稳定的pH范围内所带电荷来选择交换剂。 例如: 一蛋白质的等电点为5 若该物质在pH5~8稳定时,则应选择阴离子交换剂; 若该物质在pH5以下稳定时,则可选择阳离子交换剂。 2.强、弱离子交换剂的选择 一般来说: 强性离子交换剂适用的pH范围很广, 所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。 弱性离子交换剂适用的pH范围较窄, 在pH为中性的溶液中交换容量高,用它分离生命大分子物质时,其活性不易丧失。 故,分离生物样品习惯采用弱性离子交换剂。 3.不同离子型交换剂的选择 如: 阳离子交换剂的反离子可以是H+(称H型)、Na+(称Na型)和NH4+等。 选用何种类型离子交换剂? 取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。 一般地,选择结合力较小的反离子,以提高交换容量。 据此, 强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和0H型; 弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。 4.不同基质离子交换剂的选择 树脂基质是疏水性化合物; 纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。 这两类化合物与被分离物质之间具有不同的作用性质。 如: 吸附、分子筛、离子的和非离子的作用力等的性质, 因此,被分离物质的稳定程度和分离效果都直接受它们的影响。 在分离生命大分子物质时,一般认为纤维素、葡聚糖和琼脂糖三种基质比树脂基质更为优越。 上述三种是亲水性的,且对生命大分子物质的吸附和洗脱都比树脂基质温和, 所以,采用亲水性基质制成的离子交换剂,被分离物质活性不易受到破坏。 二、缓冲液的选择 离子交换剂不仅可以与被分离物进行交换,还可以与缓冲液中的离子进行交换。 因此,离子交换剂的吸附容量就与缓冲液的pH值和离子浓度有密切关系。 (1)起始缓冲液的选择 (A)起始缓冲液中: 适合的pH值和离子强度等 能使样品中有效成分与离子交换剂结合, 而不能使样品中杂质与离子交换剂结合。 pH值一般比有效成分的pI值高一个单位(宜选用阴离子交换剂)或低一个单位(宜选用阳离子交换剂), 离子强度变为0.1时, 就能很快把有效成分与杂质分开。 (B)或者 选择缓冲液的离子强度和pH值, 使有效成分与离子交换剂结合得不牢固, 而杂质与离子交换剂结合得牢固, 这也是得到高纯度有效成分的一种方法。 (2)洗脱液的选择 选用的洗脱液,其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来。 一般,离子强度要比起始缓冲液高; pH值是随着离子交换剂性质变化而变化。 (3)一种初步选择缓冲液的简便方法 (I)缓冲液pH值的选择 选择的关键在于了解有效成分的等电点。 对于一种提取分离的未知有效成分而言,其等电点如何,需要通过试验才能确定。 操作步骤: (如下) 取10支1.5ml试管 加入离子交换剂(在各管中等量加入) 洗涤[用不同pH值(10种)缓冲液分别洗涤10次] 平衡[用不同pH值平衡缓冲液平衡5次(各管pH值仍与洗涤液相同)] 上样(加等量的待分离样品到各管中,缓慢混合5~10min) 静止沉淀 测定各管有效成分的含量、绘制出相应图谱 (见图5-9A) 从图看出,在pH7.0以上的缓冲液中,有效成分全部被吸附了。 因此,起始缓冲液(即样品的溶解液和层析柱的平衡液)pH可选用7.0。 图5-9 (II)起始缓冲液和限制性缓冲液(洗脱液)离子强度的确定: 可采用上述“(I)”相同操作进行。 惟一有别之处是,在各管中加入的缓冲液由不同pH值改成不同离子强度。 经过洗涤、平衡、加样、测定含量,即可绘制出相应的图谱 (见图5-9B)。 由图可知, 当离子强度(μ)<0.15时,样品中的有效成分基本上全被离子交换剂吸附了; 但当μ提高到0.3或0.3以上时,情况发生了变化,有效成分却全部留存在溶液中。 因此,起始缓冲液的μ应确定为≤0.15, 而限制性缓冲液的应确定为≥0.3。 图5-9 三、加样量的确定 层析时,加样量多少与: 离子交换剂的总交换容量大小、 样品中有效成分的吸附性能、 有效成分和杂质之间的比例等因子有关。 因此,在加样之前,为找出最佳加样量,对此也需进行摸索。 其简要操作是: 在10支盛离子交换剂的试管中, 先用相同缓冲液进行充分洗涤、平衡, 然后按总交换容量的百分数,分别加入不同量的样品液, 静置,吸附, 取上清液测定待分离物的含量,并绘制相应图谱。 (见图5-9C) 从图看出,离子交换剂的总交换容量达40%时,其吸附力已呈饱和状态。 这表明该交换剂中加入样品液的最大量为总交换容量的40%。 图5-9 第四节操作 一、离子交换剂的处理、再生和转型 1.离子交换剂的处理 加过量的水悬浮出去细颗粒,而后改用酸碱浸泡,以便除去杂质并使其带上需要的反离子。 酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反粒子的类型。 离子交换剂 用水浸泡(待充分膨胀) 加过量的水(悬浮除去细颗粒) 用酸(碱)浸泡 先用水洗涤至近中性 再用碱(或酸)处理 用水洗涤至中性 经缓冲液平衡后即可使用或装柱 2.离子交换剂的再生和转型 再生: 使用过的离子交换剂,可采用一定的方法令其恢复原来的性状,这一过程叫做再生。 再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成,但有时也可以借助转型处理完成。 转型: 是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程,转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。 比如 欲使阳离子交换剂转成钠型时,则须用NaOH处理; 欲使其转成氢型时,则须用HCl处理; 欲使其带铵离子时,则须用NH4OH或NH4Cl处理。 总之,对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的,即要求其带上使用时所期望的离子或基团。 3.除掉杂质 (1)长期使用过的树脂含有很多杂质,欲将其除掉,则: 应先用沸水处理,然后用酸、碱处理。 用热的稀酸、稀碱处理,效果更佳。 (2)树脂若含有脂溶性杂质时,可用乙醇或丙酮处理。 (3)而长期使用过的亲水性离子交换剂的处理一般只用酸、碱浸泡即可。 琼脂糖离子交换剂,是在使用前仅用蒸馏水漂洗、缓冲液平衡后即可。 (4)含有较多杂质、或者需无菌操作进行、或者欲保存一段时间才用的Sepharose等离子交换剂的处理,可参看表5-9。 二、分离物质的交换 使用离子交换剂的方法有两种: 一种是柱层析法,也叫动态法: 即将离子交换剂装入层析柱内,让溶液连续通过,该法交换效率高,应用范围广; 另一种是分批法,也叫静态法: 即将离子交换剂加入盛溶液的容器内缓慢地不断搅拌,该法交换率低、不能连续进行,但是,需要的设备简单,操作容易(见实例二)。 柱层析法 其装柱的操作和要求与吸附柱层析相同。 离子交换剂的装柱量(用于分离物质的离子交换剂的总用量): 要依据其全部交换量和待吸附物质的总量(包括连续使用的全部量)来计算。 当溶液含有各种杂质时,必须考虑使交换量留有充分余地,实际交换量只能按理论交换量的25%-50%计算。 层析柱高与直径的比例要大于10: 1,用于样品浓缩和脱盐的柱高与直径的比例要降低,甚至为2: 1。 究竟何种比例效果最好,则应根据实际情况来决定。 三、物质的洗脱与收集 在离子交换层析过程中, 常用梯度溶液进行洗脱, 溶液的梯度由盐浓度或酸碱度的变化形成。 经洗脱流出来的溶液可用部分收集器分部收集。 收集的体积一般以柱体积的1%—2%为宜。 若降低分部收集体积,分辨率可以提高。 分部收集的溶液经过检测分析,便可得知所含物质的数量。 以所含物质的数量为纵坐标,以相应的洗脱体积为横坐标,就能绘制出洗脱曲线。 制备梯度溶液 制备梯度溶液的装置: 由两个彼此相通的圆筒容器和一个搅拌器组成的。 图5-11为简易的梯度混合装置。 图5-12为市售的梯度混合装置。 图5-11 在A瓶中注入开始洗脱所需的盐浓度溶液(低浓度溶液),B瓶中注入高浓度盐溶液, 若容器A1=B1时,则为线型梯度(I型); 若容器A1 若容器A1>B1时,则为凹形梯度(Ⅲ型)。 在一定时间内,不同形式的梯度溶液流经层析柱某点累积体积时的浓度C,可用下列公式计算: C=CB-(CB-CA)(1-V2/V1)B1/A1 式中: CA=梯度混合器A瓶的浓度(搅拌); CB=梯度混合器B瓶的浓度(非搅拌); A1=A瓶的横切面积; B1=B瓶的横切面积; V2=流经层析柱的体积; Vl=梯度洗脱液的总体积。 除上述三种梯度洗脱液外,还有复合式梯度洗脱液和阶梯式梯度洗脱液(见图5-13) 按组成来分,梯度洗脱溶液一般有两种: 一种是: 增加离子强度的梯度溶液。 该溶液是用一简单的盐(如NaCI或KCl)溶解于稀缓冲液制成的; 另一种是: 改变pH值的梯度溶液。 该溶液是用两种不同pH值的或不同缓冲容量的缓冲液制成的。 如果使用的是阳离子交换剂,pH值应从低到高递增; 如果使用的是阴离子交换剂,pH值应从高到低递减。 实际许可的pH值范围由待分离物质的稳定pH范围和离子交换剂限制的pH范围来决定。 洗脱液的离子强度和酸碱度的变化速率会影响层析的效果。 当: 被分离物之间的选择系数相差较小时, 洗脱液的离子强度或酸碱度的变化速率小, 这样有利于分辨率的提高。 第五节应用 离子交换层析的应用范围较广,主要是两方面: 制备、纯化生命物质; 测定蛋白质的等电点。 一、制备、纯化生命物质 用离子交换层析制备、纯化电荷量不同的生命物质时,不但被分离物的活性可以保存,而且分辨率较高。 实例: 1.用强阳离子交换树脂732分离4种核苷酸 (1)阳离子交换树脂732型技术参数: 交换量>5mg当量/g, 粒度150~300目,交联度(×8) 分离单核苷酸AMP、
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