PCR操作步骤和常见问题解决.docx
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PCR操作步骤和常见问题解决
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由
(1)高温变性模板;
(2)引物与模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是:
将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93℃-94℃)使其变性解成单链;人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合,两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短;耐热的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入,以目的基因为模板从5’→3’方向延伸,合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段,并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此,PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆与核苷酸序列分析,还可以用于突变体与重组体的构建,基因表达调控的研究,基因多态性的分析,遗传病与传染病的诊断,肿瘤机制的探索,法医鉴定等诸多方面。
通常,PCR在分子克隆与DNA分析中有着以下多种用途:
(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针;
(2) 由少量mRNA生成cDNA文库;
(3)从cDNA中克隆某些基因;
(4)生成大量DNA以进行序列测定;
(5)突变的分析;
(6)染色体步移;
(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备
1.DNA模版
2.对应目的基因的特异引物
3.10×PCRBuffer
4.2mMdNTPmix:
含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCRbuffer 5μl
dNTPmix(2mM) 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10pM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1μl
加ddH2O至 50μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。
将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。
一般:
在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:
93℃40s→58℃30s→72℃60s,循环30-35次,最后在72℃保温7min。
3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.PCR的电泳检测:
如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化
PCR反应体系由反应缓冲液(10×PCRBuffer)、脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1,Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分组成。
各个组份都能影响PCR结果的好坏。
1.反应缓冲液:
一般随TaqDNA聚合酶供应。
标准缓冲液含:
50mMKCl,10mMTris-HCl(pH8.3室温),1.5mMMgCl2。
Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。
浓度过高,使反应特异性降低;浓度过低,使产物减少。
在各种单核苷酸浓度为200μM时,Mg2+为1.5mM较合适。
若样品中含EDTA或其它螯合物,可适当增加Mg2+的浓度。
在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时,也必须相应调节Mg2+的浓度。
据经验,一般以1.5-2mM(终浓度)较好。
2.dNTP:
高浓度dNTP易产生错误掺入,过高则可能不扩增;但浓度过低,将降低反应产物的产量。
PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。
四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同,如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低),就会诱发聚合酶的错误掺入作用,降低合成速度,过早终止延伸反应。
此外,dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
因此,dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。
3.TaqDNA聚合酶酶:
在100μl反应体系中,一般加入2-4U的酶量,足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。
酶量过多将导致产生非特异性产物。
但是,不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异,由于酶的浓度对PCR反应影响极大,因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。
当降低反应体积时(如20μl或50μl),一般酶的用量仍不小于2U,否则反应效率将降低。
4.引物:
引物是决定PCR结果的关键,引物设计在PCR反应中极为重要。
要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增,通常引物设计要遵循以下几条原则:
⑴引物的长度以15-30bp为宜,一般(G+C)的含量在45-55%,Tm值高于55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。
应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列,碱基的分布应表现出是随机的。
⑵引物的3’端不应与引物内部有互补,避免引物内部形成二级结构,两个引物在3’端不应出现同源性,以免形成引物二聚体。
3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。
两条引物间配对碱基数少于5个,引物自身配对若形成茎环结构,茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多,现常常利用计算机辅助设计。
⑶人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。
⑷引物浓度不宜偏高,浓度过高有两个弊端:
一是容易形成引物二聚体(primer-dimer),二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时,容易产生非特异性产物。
一般说来,用低浓度引物不仅经济,而且反应特异性也较好。
一般用0.25-0.5pM/μl较好。
⑸ 引物一般用TE配制成较高浓度的母液(约100μM),保存于-20℃。
使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
5.模板:
PCR对模板的要求不高,单、双链DNA均可作为PCR的样品。
虽然PCR可以用极微量的样品(甚至是来自单一细胞的DNA)作为摸板,但为了保证反应的特异性,一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。
原材料可以是粗制品,某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增,但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白,将可能干扰PCR反应。
6.PCR循环加快,即相对减少变性、复性、延伸的时间,可增加产物的特异性。
四、注意事项
1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。
最好设立一个专用的PCR实验室。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。
一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸与核酸酶的污染。
操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶与管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。
RT-PCRPROTOCOL
材料与方法…………………………………………………………
1.材料………………………………………………………
1.1供试用组织(细胞)…………………………………
1.2主要仪器设备………………………………………
1.3主要试剂……………………………………………
1.4工具酶及试剂盒……………………………………
2.实验方法……………………………………………………
2.1总RNA提取…………………………………………
2.2RT-PCR………………………………………………
2.3琼脂糖凝胶电泳……………………………………
材料与方法
1. 材料
1.1 供试用动物组织/细胞
1.2 主要仪器设备
1.5ml离心管、0.2mlPCR管、高速离心机、5~10ul加样器、2~20ul加样器、20~200ul加样器、TAKARAPCR仪、551可见光透射仪
1.3 主要试剂
RNAlocker、RNAout、RNAsaver、氯仿、异丙醇、75%乙醇、琼脂糖、SYBRGREENI染料。
1.4 工具酶及试剂盒
TaKaRaOneStepRNAPCRKit
2. 方法
2.1 RNA提取与纯化
估算RNAout、组织或细胞的用量。
取组织或细胞后,将剩余的组织或细胞放入RNAlocker中保存以备下次使用。
将组织或细胞匀浆后,加入1.5ml离心管。
加入0.2倍RNAOUT体积的氯仿,振荡混匀30秒。
室温离心15000g3分钟。
将上清液转移到另一干净离心管中。
在上清液中加入等体积的异丙醇,振荡器上振荡混均30秒。
室温离心15000g5分钟,RNA沉淀将在离心底的侧面形成,小心吸弃上清液。
清洗:
在含RNA沉淀的离心管中加入1毫升75%乙醇,振荡器上振荡混均30秒。
室温离心15000g,1分钟。
小心吸弃上清液。
重复清洗步骤。
将离心管倒置于滤纸上以干燥RNA。
加DEPC水使RNA沉淀溶解,剩余的RNA沉淀使用RNAsaver溶解以备下次使用。
2.2 RT-PCR
2.2.1 取TaKaRaOneStepRNAPCRKit,按下列组成配制RT-PCR反应液。
10×OneStepRNAPCRBuffer5μl
MgCl2(25mM)10μl
dNTPMixture(10mM)5μl
RnaseInhibitor(40U/μl)1μl
AMVRTaseXL(5U/μl)1μl
AMV-OptimizedTaq(5U/ul)1μl
上游特异性引物(20μM)1μl
下游特异性引物(20μM)1μl
PositiveControlRNA或实验样品(≤1μgtotalRNA)*1μl
RnaseFreedH2O24μl
Total50μl/Sample
*当目的RNA的表达数量较少时,可加至25μl。
同时在反应体系中相应地应叫少RnaseFreedH2O的量。
2.2.2 按以下条件进行RT-PCR反应。
50℃30minRT反应
94℃2minRTase失活
94℃30sec
37℃~65℃30sec
72℃1~10minPCR反应25~30循环
● 当RNA为PositiveControlRNA时,反应条件如下。
50℃15minRT反应
94℃2minRTase失活
94℃30sec
60℃30sec
72℃1.5min25~30循环
2.2.3反应结束后,取PCR反应液(5~10l)进行琼脂糖凝胶电泳,确认RT-PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验,应将PCR产物冷冻保存。
Control反应时扩增片段大小为462bp。
2.3 RT-PCR产物确认
电泳后,将SYBRGREENI染色的凝胶用可见光透射仪观察结果,确认RT-PCR产物。
RT-PCR灵敏度:
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
RNA被降解
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA
使用良好的无污染技术分离RNA
在将组织从动物体取出后立刻处理
在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。
而且,在≥0.8mMDTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。
RNA中包含逆转录抑制剂
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。
用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。
可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括:
SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺与胍盐。
将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
多糖同RNA共沉淀
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
确定退火温度适合您的引物。
对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。
起始RNA量不够
增加RNA量。
对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
RNA模板二级结构太多
将RNA与引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
注意:
不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。
对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
注意:
不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
引物或模板对残余的RNA模板敏感
在PCR前用RNaseH处理。
靶序列在分析的组织中不表达
尝试其他靶序列或组织
PCR没有起作用
对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物
PCR灵敏度:
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
PCR引物设计较差
避免在引物3'端含有互补序列。
避免可以形成内部发卡结构的序列。
设计Tm类似的引物。
DNA含有抑制剂
诸如DMSO,SDS与甲酰胺之类的试剂会抑制TaqDNA聚合酶。
如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
富含GC的模板
对于GC含量>50%的模板,使用PCRxEnhancerSolution。
模板浓度太低
使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
镁离子浓度太低
从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板与引物对的最佳镁离子浓度。
注意:
对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
退火温度太高
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm5℃。
因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
PCR灵敏度:
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
引物浓度太低
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。
为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值与消光系数计算浓度。
(见公式1,2)
RT-PCR特异性:
在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
引物与模板非特异性退火
在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
GSP设计较差
遵循用于扩增引物设计的同样原则
RNA中沾染了基因组DNA
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。
使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
形成引物二聚体
设计在3'端没有互补序列的引物。
引物与模板非特异性退火
以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
使用PlatinumTaqDNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
镁离子浓度太高
对于每一个模板与引物组合优化镁离子浓度。
因为扩增复杂模板导致引物错误起始
使用巢式PCR或递减PCR。
沾染外源DNA
使用抗气雾剂的吸头与UDG(见第八章)。
因为二级结构导致引物结合位点无法接近
对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRxEnhancerSolution。
PCR忠实性:
PCR在产物序列中引入了错误
聚合酶忠实性低
使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如PlatinumPfxDNA聚合酶。
循环数太多
降低循环数。
四种dNTP的浓度不同
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。
使用预混合物。
定量RT-PCR
无扩增产量
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照
无cDNA合成
cDNA合成温度太高
降低保温温度
反转录cDNA产物被二级结构封闭
提高保温温度。
重新设计引物
RNA被损害或降解
必要的话更换RNA
RNAse污染
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
荧光探针无功能
确保探针设计的有效性与fluorophore与quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。
必要的话设计与合成探针。
灵敏度低
须在比预期更高的循环中检出产物
初始模板RNA不充分
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
RNA被损害与降解
必要的话更换RNA
RNAse污染
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
无效的cDNA
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
无效的PCR扩增
注意:
反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠与亚精胺
调整cDNA合成温度或引物设计
信号高于预期
在低于预期的循环中即可检出产物
反应中加的样品太多
降低模板的浓度
模板或PCR残余污染
隔离污染来源,更换试剂
使用专用的精致移液器。
在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
电泳后出现意外的条带
RNA被基因组DNA污染
用DNaseI预处理RNA
用于第一链合成的寡聚dT或随机引物
使用基因特异性引物
PCR的低特异性
优化PCR条件
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