hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达.docx
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hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达
hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达
【摘要】目的:
构建人类促甲状腺激素受体(hTSHR)胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf(aa29~100)、hTSHRe(aa101~278)的真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe,并在CHO细胞中进行表达。
方法:
RTPCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO中,经酶切、PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达,RTPCR扩增转染细胞的cDNA、Westernblot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达。
结果:
RTPCR分别扩增两个片段的阳性克隆株,所得片段大小与预期一致,经Westernblot鉴定,相对分子质量(Mr)分别为11900、23600左右,与预期的大小相符。
结论:
真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe构建成功,RTPCR和Westernblot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达,为进一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在体内的基因表达,建立Graves'病的动物模型奠定了基础。
【关键词】TSH受体真核表达Graves’病
人TSHR是一种跨膜性蛋白,属于G蛋白偶联受体,具有7次跨膜结构,体内主要分布在甲状腺滤泡细胞膜上。
hTSHR蛋白由764个氨基酸组成,相对分子质量(Mr)为84500,分为膜内区、跨膜区以及膜外区3个部分[1,2],编码hTSHR膜外区的基因长度是1300bp,研究表明TSHR是许多自身免疫性甲状腺疾病(autoimmunethyroiddisease,AITD)中主要的自身抗原之一,TSHR膜外区(TSHRextracellulardomain,TSHR
ECD)是其免疫原性区段,抗TSHR的抗体大多结合于此段。
本研究中克隆hTSHRECD氨基端的2个片段编码序列(188~403bp,407~904bp),构建其真核表达载体,并转染CHO细胞,进行稳定表达。
1材料和方法
1.1材料CHO细胞由中国医学科学院血液病研究所药理室熊东升研究员惠赠,酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司,Ham’sF12、G418、OptiMEM无血清培养基购自Gibco公司;FBS和bTSH购自Sigma公司。
真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO和感受态E.coliTOP10购自Invitrogen公司。
DNA快速纯化回收试剂盒、限制性内切酶HindⅢ以及PyrobestDNA聚合酶购自TaKaRa公司;MMLV逆转录酶试剂盒、化学发光试剂盒购自Promega公司;质粒回收纯化试剂盒购自博大泰克公司;TRIzol试剂、脂质体LipofectamineTM2000Reagent及小鼠AntiHis单克隆抗体(mAb)购自Invitrogen公司;引物设计合成由上海英俊公司完成。
1.2方法
1.2.1PCR引物设计与合成根据GenBank公布的hTSHRcDNA序列(GenBank:
000369)序列分别设计片段188~403bp的引物F4:
5′caccatggagtgccatcaggaggag3′,R4:
5′actcaaattgtagaaggagtgtg3′;片段407bp~940bp的引物F5:
5′caccatggtgactcacatagaaat3′,R5:
5′tgggtaagaaaggtcagcc3′。
上游引物的5′端序列起始密码子ATG前加人Kozak序列(划线部分)以提高转录起始的效率[3]。
1.2.2组织材料获取与总RNA的提取人正常甲状腺组织30mg,加入1mLTRIzol,匀浆后加入200μL氯仿,摇匀,室温孵育2~3min,4℃,11000g离心15min,取上清水相至新离心管中;加400μL异丙醇,室温孵育10min,4℃,11000g离心10min;弃上清,用1mL750mL/L乙醇洗涤1次,4℃,11000g离心5min;弃上清,空气中干燥10min,加RNasefree水溶解,测RNA浓度,-70℃保存。
1.2.3RTPCR将人甲状腺正常组织RNA,逆转录为cDNA,以hTSHRcDNA为模板,用PyrobestDNA聚合酶PCR扩增TSHR片段,上下游引物分别1μL(10mmol/L),dNTP1μL(2.5mmol/L),10
×buffer2.5μL,PyrobestDNA聚合酶0.30μL(1U),模板2μL(约150ng),ddH2O17.2μL。
反应参数:
95℃预变性2.5min,95℃变性45s,hTSHRf62.7℃、hTSHRe54.1℃退火45s,72℃延伸45s,34个循环;72℃再延伸5min。
10g/LTAE琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。
1.2.4载体构建与鉴定将回收的hTSHRf、hTSHRe分别与载体1.5∶1混合进行连接,然后将重组体转化E.coliTOP10,冰上放置5~30min,42℃热休克30s后,立即置于冰上,加250μL的S.O.C培基37℃摇床,1h;铺板于Amp+的琼脂糖培养基上,37℃温箱孵育16h;挑取单个菌落于LB液体培养基中,扩大培养,小量提取质粒DNA,以质粒DNA为模板,分别以F4∶R4和F5∶R5为引物,PyrobestDNA聚合酶扩增hTSHR,反应条件同上;经HindⅢ酶切后15g/L琼脂糖凝胶电泳;测序鉴定由上海英俊生物公司完成。
1.2.5CHO细胞转染与阳性克隆筛选
(1)转染用重组质粒的制备及纯化:
按照提取质粒试剂盒说明大量提取重组质粒,并去除内毒素,A260/A280在1.8~2.0之间,-20℃保存,用于转染。
(2)脂质体转染:
CHO细胞用Ham’sF12完全培养液(含100mL/LFBS,10mL/LHT,5mL/L双抗)常规培养,传代。
转染前先对CHO细胞进行毒性筛选,以确定其最小致死量,将细胞铺板于96孔板中,细胞密度为2×104/孔,G418毒性筛选后确定最小致死量为500mg/L。
转染前1d,以2
×104/孔CHO细胞接种于96孔板,每孔加100μL不含抗生素的Ham’sF12培养基,使其融合密度为90%,用25μLOPTIMEMI培养基分别稀释320ngDNA和0.8μL脂质体2000,后者稀释后室温孵育5min,混合稀释的DNA和脂质体,室温保温20min;然后直接将复合物加入到每孔中,37℃、50mL/LCO2孵育4~5h后更换生长培养基;次日,将细胞传代至新鲜培养基中,48h后加入500mg/LG418筛选阳性克隆株,进行2~3周的稳定表达。
1.2.6目的基因在mRNA水平表达分别提取转染后和未经转染的CHO细胞的总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,F4∶R4和F5∶R5为引物,PCR分别进行扩增,反应参数同上。
1.2.7目的基因蛋白水平的表达用200μL细胞裂解液裂解稳定表达的CHO细胞制备蛋白样品[4],120g/L的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后,将凝胶在转移缓冲液中浸泡15min,PVDF膜剪成凝胶大小在转移缓冲液中浸泡10~15min,恒流0.8mA/cm2,转膜1~2h;50g/L脱脂奶粉的PBST4mL,4℃封闭过夜,次日,PBST洗膜,5min/次;由于构建的重组表达蛋白的羧基端有多聚组氨酸6×His的蛋白标签,一抗用小鼠AntiHismAb(1∶8000)4mL,37℃孵育2h;洗膜(同上);加HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶8000)2mL,37℃孵育1h;洗膜(同上)。
按照化学发光法说明书,用发光检测液浸泡PVDF膜后,在暗室中曝光30s,显影1~2min,定影5min,室温干燥。
2结果
2.1目的基因的获取提取人正常甲状腺组织RNA,经RTPCR后,扩增产物经回收后10g/L琼脂糖凝胶电泳,分别可见约220bp、540bp大小片段,与预期相符。
图1目的基因RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳分析(略)
Fig1AnalysisofRTPCRproductofhTSHRgenebyagarosegeleletropheresis
M:
DNAmarkerDL2000;1:
hTSHRf;2:
hTSHRe.
2.2重组质粒的转化与鉴定pcDNA3.1D/V5HisTOPO为定向克隆载体,2个片段均正向插入载体,hTSHR全长HindⅢ的酶切位点有3个:
272bp、784bp和1236bp,载体的HindⅢ的酶切位点在T7启动子附近,HindⅢ在T7和272bp对pcDNA3.1hTSHRf进行酶切,T7启动子与TOPO异构酶的识别位点之间以及188bp与272bp之间片段长度约为130bp;HindⅢ在T7和784bp对pcDNA3.1
hTSHRe酶切,T7启动子与TOPO异构酶的识别位点之间以及407bp与784bp之间片段长度约为430bp,证实重组质粒的大小及插入方向是正确的(图2);测序结果与GenBank中hTSHR的相应片段序列相同。
以质粒为模板PCR扩增产物大小分别约为220bp、540bp,与预期大小相符。
图2重组质粒pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe经HindⅢ酶切鉴定(略)
Fig2RestrictionendonucleaseHindⅢanalysisoftherecombinantplamidspcDNA3.1hTSHRfandpcDNA3.1hTSHRe
M:
DNAmarkerDL2000;1:
pcDNA3.1hTSHRf;2:
pcDNA3.1hTSHRe.
2.3转染细胞中hTSHRmRNA表达鉴定RTPCR鉴定阳性克隆细胞,扩增产物分别约为220bp、540bp,证明hTSHRf和hTSHRe已经成功整合在CHO细胞基因组中,并能够转录,而未经质粒转染的细胞未扩增出任何条带(图3)。
图3RTPCR检测目的基因的表达(略)
Fig3RTPCRamplifyingcDNAofCHOcellstransfectedbyrecombinantplamidspcDNA3.1hTSHRfandpcDNA3.1hTSHRe
M:
DNAmarkerDL2000;1:
RTPCRamplifyingcDNAofCHOcellsnontransfected;2:
pcDNA3.1hTSHRf;3:
pcDNA3.1hTSHRe.
2.4Westernblot鉴定TSHR蛋白水平的表达裂解阳性细胞株,经SDSPAGE电泳后转印到PVDF膜,与小鼠AntiHismAb结合,HRP标记的羊抗小鼠IgG作为二抗,ECL法显色,根据标准分子量计算后,特异条带的Mr约为11900、23600,与预期相符(图4)。
图4Westernblot检测目的基因的表达(略)
Fig4WesternblotofhTSHRfandhTSHRe 3讨论
GD是一种常见的AITD,其自身抗体TSAb可模拟TSH功能,兴奋TSHR,通过多种途径调节甲状腺细胞的生长、分化,激素的合成和分泌,最终导致GD的发生。
建立合适的GD动物模型是人们一直以来研究的热点,目前,报道的建立GD动物模型的方法包括TSHR真核表达质粒免疫、表达TSHR的腺病毒免疫[5]、表达TSHR的成纤维细胞或M12细胞免疫[6]、外源性注入TSHR活化T细胞以及TSAb转基因动物模型等,最近有报道在体内电穿孔法注射DNA
TSHR复合物建立GD模型[7],TSHR核酸免疫被认为是目前建立GD等AITD动物模型的最有希望的一种方法。
Kim等[8]证明18.5%的GD患者体内有TSAb和TBAb两种抗体,但主要是TSAb占优势,95%以上未经治疗的GD患者血循环中均可检测出TSAb。
研究表明,TSHRECD是TSH以及TSHR自身抗体的主要作用部位,并拥有多个TSH的结合位点、自身抗体的结合表位以及特异的免疫原肽[9],因此,研究TSHRECD功能对于了解GD发病的分子机制方面尤为重要。
研究发现TSAb大多数表位是位于TSHRECD的氨基端(aa34~37、40~45及52~56[10]),Schwarz等[11]研究证实,建立GD模型不论是用表达TSHR的腺病毒免疫还是用TSHR的DNA免疫,TSHR的显性表位都位于其氨基端的富含半胱氨酸的残基aa21~41。
报道的真核表达载体大多是用hTSHR全长构建的,在前期的研究中,我们针对性地用hTSHRECD氨基端的753bp成功构建了真核表达质粒[12],为了进一步研究片段的功能,我们又将其分成2个片段(aa29~100,aa101~278),分别构建了重组质粒pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe,因该载体具有定向克隆功能,保证了片段与载体正确定向的连接,简化了克隆的过程和筛选的步骤,并能使重组蛋白在CHO细胞中高效表达。
结果显示,RT
PCR扩增阳性克隆细胞株,证实了hTSHR在mRNA水平的表达;Westernblot证明hTSHR在蛋白水平有表达,为进一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在体内的基因表达,建立GD动物模型奠定了实验基础。
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