新冠核酸检测质量管理制度.docx

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新冠核酸检测质量管理制度

****医院

新冠核酸检测质量管理制度（2022）

（一）提高核酸检测规范性和时效性

要统一新冠病毒核酸检测结果报告单格式，检测部门要通过自助打印、网络查询、快递邮寄等多种方式，为受检者出具检测报告。

对于发热门诊患者的核酸检测，要在6小时内报告结果，争取缩短至4小时报告；对于普通门急诊、住院患者及陪护人员等人群的核酸检测，原则上要在12小时内报告结果；对于“愿检尽检”人群的核酸检测，一般在24小时内报告结果。

（二）持续开展核酸检测培训

要大力开展新冠病毒核酸检测培训，按照《新冠肺炎实验室检测技术指南》《新冠核酸检测技术人员培训方案》等文件要求，加强标本采集、保存和运输、标本接收整理、核酸提取、试剂使用、荧光定量等检测方法、结果报告、生物安全等全流程培训。

通过培训，确保各环节操作规范，进一步提高检测技术水平。

（三）推动医疗机构互认检测结果

要结合本地疫情防控需要，制订核酸检测结果互认规定，明确互认的条件、有效期、医疗机构范围等，最大程度减少重复检测。

检测部门要组织参加室间质评，保证每年至少参加1次室间质评。

要加强实验室室内质控，常态化接受国家级或省级临床检验质量控制，保证检测质量。

****医院

新冠核酸检测要点总结（2022）

一、SARS-CoV-2核酸检测的原理

二、核酸检测对于SARS-CoV-2检测的意义

三、实验室进行SARS-CoV-2核酸检测的条件和要求

四、SARS-CoV-2核酸测定（实时荧光RT-PCR）关键环节

五、SARS-CoV-2核酸测定（实时荧光RT-PCR）结果判读

六、SARS-CoV-2检测出现假阴性的原因

七、如何降低SARS-CoV-2核酸检测假阴性

八、康复出院患者SARS-CoV-2核酸检测复检阳性原因九、总结

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）可引起新型冠状病毒肺炎（C0VID-19）,目前已在全球范围内广泛流行。

疫情暴发初期，因发展迅速，对疑似患者进行快速确诊是防治C0VID-19的关键，部分获批的核酸检测试剂研发时间短，存在性能确认仓促、试剂优化不充分以及批间差异大等问题；各临床实验室在开展核酸检测过程的各个环节中存在的问题也可能影响核酸检测结果的准确性。

本文将围绕目前SARS-CoV-2核酸检测中的关键环节及要点进行评述，并对实验室核酸检测与临床不符假阴性和复检阳性的问题进行分析。

一、SARS-CoV-2核酸检测的原理

SARS-CoV-2是一种RNA病毒，基因组序列约29kb,拥有10个基因，可有效编码10个蛋白。

病毒由RNA和蛋白构成，最外层是由脂质和糖蛋白组成的包膜外衣，里面蛋白衣壳将RNA包裹在其中，从而使容易降解的RNA得到保护。

病毒通过特定细胞表面受体入侵细胞造成感染，并利用宿主细胞进行复制。

病毒核酸检测的原理就是通过细胞裂解液，让病毒的RNA裸露出来，然后用实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行检测。

检测原理最关键的是利用引物和探针来实现核酸序列的“靶向匹配”,即寻找SARS-CoV-2约3万个碱基中区别于其他病毒的核酸序列（与其他病毒核酸相似度“低”的区域），设计引物和探针。

引物和探针与SARS-CoV-2核酸特定区域高度匹配，即特异性很强，一但待检样本实时荧光RT-PCR扩增结果为阳性，则证明该样本中存在SARS-CoV-2o

二、核酸检测对于SARS-CoV-2检测的意义

依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》要求：

疑似病例同时具备以下病原学或血清学证据之一者：

1.实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；

2.病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；

3.新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；

4.新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期IgG抗体滴度较急性期呈4倍及以上升高。

因此，SARS-CoV-2核酸检测（实时荧光RT-PCR）结果阳性是确诊感染的重要证据之一；但如果检测结果为“阴性”，不能作为判断患者未被感染的标准。

有研究结果显示，1100例C0VID-19患者在入院时接受电子计算机断层扫描（CT）检查时，有76.4%的患者呈现出肺炎表现，主要为毛玻璃样阴影（50.0%）和双肺斑片状阴影（46.4%）,绝大多数重症患者都能以此确诊。

而根据此前专家表述的“确诊患者中，核酸检测的阳性率仅为30%〜50犷来看,COVID-19患者核酸检测假阴性的比例并不低。

因此核酸检测不能作为确诊感染的唯一方法。

三、实验室进行SARS-CoV-2核酸检测的条件和要求

临床实验室需要符合国家卫生健康委办公厅颁布的《关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》的要求：

达到二级以上实验室生物安全防护及三级个人生物安全防护规范并经卫生行政相关部门批准，方可开展SARS-CoV-2核酸检测。

核酸检测实验室为负压环境最为理想，应注意压力监测，保持空气流动，排除气溶胶。

核酸检测人员必须具备相应资质，接受聚合酶链反应相关培训并考核合格。

实验室应严格管理，分区到位，严格禁止无关人员进入。

清洁区应保持通风，消毒到位。

相关物品分区放置，洁污分离，按时更换，洗消到位。

常规消毒：

较大面积以含氯消毒液为主，小面积可以用75%酒精。

处理气溶胶的良好方式是开窗通风，也可通过紫外线、过滤、空气消毒机等方式进行空气消毒。

四、SARS-CoV-2核酸测定（实时荧光RT-PCR）的关键环节和参数

尽管实验室一般会很关注核酸“检测”环节，但实际上核酸“提取”也是检测成功的关键环节之一，其与病毒样本的采集和保存密切相关。

在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》中，所提到的样本类型包含呼吸道样本、血液样本、粪便样本等。

对于高风险的样本，在核酸提取和扩增前需要对样本先行病毒灭活，包括（60〜65）。

（3孵育（20~30）min,或者用试剂盒自带的采样液灭活和保存病毒。

目前应用最广泛的呼吸道样本，如鼻咽拭子等均采用第2种方式，即以核酸提取裂解液为基础配制的灭活（保存）液。

这种病毒保存液一方面可让病毒的蛋白变性，失去活性，不再有传染性，提高运输和检测阶段的安全性；另一方面又可直接裂解病毒释放核酸，消除核酸分解酶，防止病毒的RNA降解。

以核酸提取裂解液为基础配制的病毒采样液，主要成分为平衡盐类、乙二胺四乙酸螯合剂、胭盐（异硫氟酸服、盐酸胭等）、阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）、阳离子表面活性剂（十四烷基三甲基草酸较）、苯酚、8-羟基喳琳、二硫苏糖醇、蛋白酶K等几种或多种组分。

目前，核酸提取的试剂盒种类繁多，采用的核酸提取纯化试剂各不相同，即使是采用相同的核酸提取纯化试剂，各试剂盒的提取程序也有所不同。

目前国家药品监督管理局批准的核酸检测试剂盒产品均基于SARS-CoV-2基因组中ORFlab、E和N基因进行选择。

不同产品的检测原理基本一致，但是其引物、探针设计不同，有单靶区段（ORFlab）、双靶区段（ORFlab.N或E）、三靶区段（ORFlab.N和E）的检测和判读差别，核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系应参考相关试剂盒说明书，并建议使用者严格按照试剂盒说明书规定的判读方式进行判读。

五、SARS-CoV-2核酸测定（实时荧光RT-PCR）结果判读

《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案（第二版）》［7］首次明确了单个基因扩增结果的判断标准:

1、无Ct或Ct240为阴性；

2、Ct<37为阳性；

3、Ct值37〜40为灰度区，建议重复实验，若重做结果Ct<40,扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

之后的第三版指南、第四版指南［9］延续了上述标准，但是由于商品化试剂盒选用的靶标有所不同，上述3版指南并未给出靶标的组合判断标准，强调以厂家提供的说明书为准。

从第五版指南开始，明确了2个靶标，尤其是比较难判断的单靶标阳性的判断标准，即实验室要确认某个病例为SARS-CoV-2核酸检测阳性，需满足以下2个条件中的1个：

（1）同一份样本中SARS-CoV-22个靶标（ORFlab.N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性，如果出现单个靶标阳性的检测结果则需要重新采样并重新检测，如果检测结果仍然为单靶标阳性，则判定为阳性；

（2）2种样本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性或同种类型样本2次采样检测均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。

但是，指南同时强调核酸检测的阴性结果不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括样本质量差（口咽等部位的呼吸道样本）、样本收集过早或过晚、没有正确保存、运输和处理样本、技术本身存在问题（病毒变异、PCR抑制）等。

六、SARS-CoV-2检测出现假阴性的原因

目前被关注的核酸检测“假阴性”概念，往往是指核酸检测结果与临床表现不符的“假阴性”，即临床症状及影像学结果高度疑似COVID-19,但核酸检测多次始终为“阴性”。

国家卫生健康委临床检验中心对

SARS-CoV-2检测“假阴性”进行了解释。

（1）被感染者的细胞中有一定量的病毒。

现有数据显示机体被病毒感染后，病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部，再到气管和支气管，进而到达肺泡，感染者会经历潜伏期、轻度症状、再到严重症状的过程，不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同。

从细胞种类的病毒载量看，肺泡上皮细胞（下呼吸道）＞气道上皮细胞（上呼吸道）〉成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等；从样本类型来看，肺泡灌洗液（最优）＞深咳痰〉鼻咽拭子〉口咽拭子》血液。

此外，粪便中也能检出病毒。

但是考虑操作的方便性和患者的接受程度，目前临床常用的样本顺序是口咽部拭子》鼻咽部拭子》支气管灌洗液（操作复杂）和深痰（常为干咳，难得到）。

因此，某些患者口咽部或鼻咽部细胞中病毒量较少或极低，如果只取口咽部或鼻咽部样本检测，病毒核酸就检测不到。

（2）样本采集时未采集到含有病毒的细胞，或未有效保存病毒核酸。

①采集部位不当，如采集口咽拭子时，采集深度不够，采集鼻咽拭子没有采到鼻腔深处等，可能采集到的细胞绝大部分都是不含病毒的细胞；

②采样拭子使用错误，如拭子头的材料推荐使用PE纤维、聚酯纤维、聚丙烯纤维等合成纤维，实际操作中使用了棉花等天然纤维（对蛋白质的吸附较强，不易洗脱）和尼龙类的纤维（吸水性不佳，导致采样量不足）；

③病毒保存管使用错误，如误用了易吸附核酸（DNA/RNA）的聚丙烯或聚乙烯塑料保存管，导致保存液中核酸浓度下降。

实际操作中推荐使用聚乙烯-丙烯聚合物塑胶与某些特殊处理的聚丙烯塑胶容器储存病毒核酸。

（3）体外诊断试剂性能不佳。

部分品牌的试剂由于研发时间短，也没有使用已知临床样本进行必要的性能确认，可能存在对试剂优化不充分以及试剂批间差异大等问题。

此外，国家卫生健康委临床检验中心202*年3月16—24日开展的SARS-CoV-2核酸检测室间质量评价发现，各“检测”试剂均存在与多个核酸“提取”试剂搭配使用的情况，这也是导致假阴性结果的主要原因。

即使采用同一核酸检测试剂，由于核酸提取试剂的不同，分析敏感性也必然会存在差异。

（4）临床实验室操作不规范。

样本运输保存条件、临床实验室的规范操作、结果判读和质量控制等是保证检测结果准确、可靠的关键因素。

国家卫生健康委临床检验中心202*年3月16—24日开展的室间质量评价结果显示，收到有效结果的844家实验室中，701家（83.1%）合格，143家（16.9%）不合格，实验室总体检测情况良好，但不同实验室在人员操作能力、单靶标阳性样本解读能力以及质量控制方面仍存在差异。

七、如何降低SARS-CoV-2核酸检测假阴性

降低核酸检测假阴性应相对应地从产生假阴性的4个方面进行优化。

（1）被感染者的细胞中有一定量的病毒。

疑似感染者不同时期，在身体不同部位，病毒浓度会有差异，如咽部没有，可能支气管灌洗液或粪便中有，若能同时或在疾病进展的不同阶段采集多种类型样本进行检测，会有助于避免假阴性的