米氏常数测定方法资料.docx

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米氏常数测定方法资料

酶活米氏常数实验

一、实验前准备

1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。

2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。

TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。

3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。

4、记录本上提前写好实验的加样顺序：

催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：

①200µL缓冲液②10µL催化剂③底物TMB（ABTS）（0，0.5，1，2，4，6，8，10µL）④32µLH2O2（排枪加）

催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：

①200µL缓冲液②10µL催化剂③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL）④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）

数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。

Code

1

2

3

4

5

6

7

Time

TMB

0

0.5

1

2

4

6

8

10

V01

Code

1

2

3

4

5

6

7

Time

H2O2

2

4

6

8

10

16

32

64

V01

二、实验

1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。

电脑开机，密码为mby-nano，双击酶标仪软件图标

，出现登录框

，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面

，若底物为TMB，选择“铁动力学”（波长为650nm）

，选择模板1

；

打开电脑内置时钟，

若底物为ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为405nm）

。

新建一个word文档，以日期命名，打开。

2、加样：

96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。

以TMB为例，从第1列加样：

①从A1至H1，每孔加200µLNaAc/HAcBuf；

②从A1至H1，每孔加10µL催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；

③从A1至H1，每孔分别加不同体积（0，0.5，1，2，4，6，8，10µL）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；

④用排枪吸取32µLH2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：

00：

00）

Code

1

2

3

4

5

6

7

Time

00：

00

00：

30

01：

00

01：

30

02：

00

02：

30

03：

00

03：

30

TMB

0

0.5

1

2

4

6

8

10

V01

用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。

亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。

每次读板出来结果后，点击“结果入库”——>“是”——>“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。

若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。

（现已可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法）

3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。

第二、三、四组同第一组的操作。

保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。

4、若当天不再继续实验，将24孔板中剩余的H2O2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。

移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。

三、数据处理

1、打开Origin6.1，点击右上角的“AddNewColumn”（箭头所指）：

，亦可右击——>AddNewColumn

。

2、输入数据：

命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。

X列时间从0-180s，0s对应微孔板编号1的数据，30s对应code2的数据，以此类推，将所读数据输入。

点击“file”—>“SaveProjectAs”

，

保存文件名为“第一组”

。

3、数据输入完成后，选择X和Y列，点击左下角的“点图”标志（箭头所指）

作出点图，点击Analysis—>FitLinear作线性拟合

，

在结果对话框里，拟合的方程为Y=A+B*X，B的值为拟合得出的斜率即反应的初速度V

，

同样方法得出不同TMB体积对应的反应初速度V，记录数据：

Code

1

2

3

4

5

6

7

Time

00：

00

00：

30

01：

00

01：

30

02：

00

02：

30

03：

00

03：

30

TMB

0

0.5

1

2

4

6

8

10

V01

0

0.00714

0.00902

0.01162

0.01425

0.01597

0.01547

0.017

同样方法得出第二、三、四组的反应初速度V，记录数据。

4、新建NewProject，数据表1中命名X列为底物（TMB）浓度，列中数据为A-H对应的孔中TMB的物质的量浓度（一般用µmoL/L）；挑选三组比较好的初速度V，输入Y列

。

选中初速度V的三列，右击—>StatisticsonRows

，

得出数据表2，选定Mean和sd列中的值，右击复制，粘贴至数据表1中

，

选定sd列，右击—>SetAs—>YError，将标准方差设为误差棒

。

选定X列、Mean列和sd列，画点图

，

点击Analysis—>Non-linearCurveFit，作非线性拟合

拟合的方程为米氏方程y=P1*x/（P2+x），y为反应初速度，x为底物浓度，P1为Vmax值，P2为米氏常数Km值（若软件中没有此方程，可点击New新建方程，之后也可点击Edit编辑方程）

；点击StartFiting，得出对话框

，点击ActiveDataset，

，设定P1、P2初始值为1，

，点击10lter进行非线性拟合，得出

，记录Vmax和Km值。

可双击X或Y轴修改坐标轴名称

，

点击图上方的“T”标志

可在图上插入文本框，将Km和Vmax值写入

。

5、保存结果。

6、计算Kcat值

Kcat表示每个酶分子在单位时间内催化底物的分子数，反应了酶催化能力的大小。

根据下面的公式计算：

（1）

（2）（3）

v的单位为Ms-1；vmax为非线性拟合得出的值，单位为s-1；ε=39000M-1·cm-1；l为反应体系的高度，96孔板每个孔的高度为1cm，每个孔的容积为300µL，可根据反应体系的平均体积占300µL的比例来计算反应体系的高度；[E]为催化剂的浓度，单位为M；m为催化剂的质量，可根据加入催化剂的体积和催化剂溶液的浓度计算得出；r为催化剂粒子的半径，以透射电镜测出的粒径计；ρ为催化剂的密度，单位为g/cm-3；NA为阿伏伽德罗常数，值为6.02×1023；V为反应体系的平均体积；Kcat单位为s-1。

附：

直接拷数据方法：

1.每次读板后，数据结果入库，待全面测完，按照当天的日期在桌面的DATA文件夹中查找自己的数据，格式为记事本，如20100825.txt，该文件拷入自带u盘。

2.选中该记事本文件，右击打开方式，选择用写字板打开，如图

打开后如下：

3.按ctrl+A，将写字板文件中全面数据选中，复制，新建一个word文档，粘贴。

4.选中某一列数据：

先将鼠标指针放在该列数据的第一个数据前面，然后按住alt键，向右下方拖动，直到黑色黑色区域将该列数据全面覆盖，注意不要覆盖其他数据，如图：

5.选中之后先松开鼠标，再松开alt键，选中后不要点击鼠标（左右键都不要点），按ctrl+c复制该列数据。

6.打开origin软件，选中某列，按ctrl+v即可将该列数据拷入选中列，如图：

7.友情提示：

在直接拷取数据时，如遇到不能直接拷入origin中时，可在word中插入表格，选中表格中一行或一列，将从txt中复制的数据粘贴进去，再在表格中重新选中数据，复制，即可一一对应的拷入origin中的表格中。

8.后续步骤按以上操作指示进行（按ctrl键点击该处）