乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测.docx
- 文档编号:11282317
- 上传时间:2023-02-26
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:18.66KB
乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测.docx
《乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测
乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测
YLNB3.2
1、引用依据:
GB/T4789.3-2003
2、术语和定义
大肠菌群:
指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性
厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便,
故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品
中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能
数(MPN)表示。
3、仪器及器材
3.1恒温培养箱:
36±1℃;
3.2冰箱:
0-4℃;
3.3恒温水浴锅:
46±1℃;
3.4天平;
3.5显微镜;
3.6均质器或乳钵;
3.7灭菌平皿:
直径90mm;
3.8灭菌试管:
18×180和20×200;
3.9灭菌吸管:
1ml和10ml;
3.10灭菌广口瓶或三角烧瓶:
容量为500ml;
3.11灭菌玻璃珠:
直径约5mm;
3.12载玻片;
3.13酒精灯;
3.14试管架;
3.15灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。
4、培养基和试剂
4.1乳糖胆盐发酵管;
4.2伊红美兰琼脂平板;
4.3乳糖发酵管;
4.4生理盐水;
4.5革兰氏染色液。
5、检验程序
大肠菌群检验程序:
检样
稀释
乳糖胆盐发酵管
36±1℃,24±2h
不产气产气
大肠菌群阴性伊红美兰琼脂平板
36±1℃,18~24h
报告
革兰氏染色乳糖发酵管36±1℃,24±2h
革兰氏阳性革兰氏阴性无芽孢杆菌产气不产气
大肠菌群阴性大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
6、方法
6.1检样稀释
6.1.1以无菌操作将检样25ml(或g)放于装有225ml灭菌
生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量
的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成
1:
10的
均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8000~10000r/min
的速度处理1min,做成1:
10的均匀稀释液。
6.1.2用1ml灭菌吸管吸取1:
10稀释液1ml,注入含有9ml
灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成
1:
100的稀释液。
6.1.3另取1ml灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀
释液,每递增稀释一次,换用一支1ml灭菌吸管。
6.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选
择三个稀释度,每个稀释度接种3管。
6.2乳糖发酵实验:
(通常所说的假定试验:
其目的在于检
查样品中有无发酵产生气体的细菌)
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1ml以上者,
用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆
盐发酵管。
每一稀释度接种3管,置36±1℃培养箱内,培
养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大
肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
6.3分离培养:
(目的在于检查乳糖初发酵试验呈阳性反应
的试管内,有无需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌存
在)
将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上,置36±
1℃培养箱内,培养18~24h,然后取出,观察菌落形态,并
做革兰氏染色和证实实验。
6.4证实实验(复发酵实验):
(目的在于证明从乳糖初发
酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆
菌,确能发酵乳糖产生气体)
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏
染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃培养箱内,培养24
±2h,观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的
无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阴性。
6.5报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数查MPN检索表,报告每100ml
(g)大肠菌群的最可能数(见表1)。
7、注意事项
7.1初发酵和证实试验
乳糖发酵试验不是纯菌的发酵试验,所以初发酵阳性并
不代表大肠菌群阳性,因此,必须作进一步证实试验。
7.2产气量与倒管
试验表明,大肠菌群的产气量与大肠菌群的检出率呈正
相关系。
但也随样品的种类而变。
大肠菌群的产气量多者可
充满整个倒气管,少者可产生比小米粒还小的气泡。
如果对
产酸但未产气的乳糖发酵管如有疑问,可用手轻轻打动试管,
如有气泡沿管壁上浮,即应考虑可能有气体产生,而应作进
一步试验。
另外,产气量与倒气管有一定的关系,倒气管口
不完整,有利于气体的进入;管口周围有沉淀等物质能影响
气体的进入。
7.3挑选菌落
在平板呈现紫黑色,有或无金属光泽,检出率最高;粉
红色、粉色检出率最低。
另外,只挑选一个菌落影响大肠菌
群的检出率,当菌落不典型时,应挑取2~3个菌落作证实
试验,以免出现假阴性。
7.4抑菌剂
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸
钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。
胆盐的主要作用是
抑制其它杂菌,特别是革兰氏阳性菌的生长。
有些抑菌剂用
量甚微,称量时稍有误差,即可对抑菌作用产生影响,因此
抑菌剂的添加应严格按照标准方法添加。
7.5指示剂
溴甲酚紫属于酸碱指示剂,其pH变色范围为:
黄5.2~
6.8紫,当料管中培养基(pH=7.4±0.1)的颜色由紫色变为
黄色时,证明培养基中有酸性物质产生,此时培养基的PH
≤5.2,培养基呈酸性。
7.6MPN检索表
MPN为最大可能数的简称,表示样品中活菌的密度,是用
概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
MPN检索表只给出
了三个稀释度,如果改用不同的稀释度,则表内数值应相应
降低或增加10倍。
7.6.1用于初发酵试验或复发酵试验的小导管内应无气泡,有气泡时就不能使用,接种之后,要用同批未接种的发酵管置于温箱内,同时培养,作为空白。
7.6.2检查初发酵试验的乳糖胆盐管内是否有乳糖分解菌存在时,应以产气为主,产酸仅作参考。
因为培养基中所用
的指示剂为溴甲酚紫,其有效PH为5.2-6.8,变色点为6.0,
如果产酸未能达到使下降至6.0以下时,变色就不显著。
7.6.3检查发酵管中小导管内气泡时,即使只有微量气泡出现,亦应判定为阳性。
有时小导管的管口被样品颗粒封住,气体未能进入导管,如加以振摇,管低有小气泡上升,亦应视为阳性。
7.6.4大肠菌群细菌能分解乳糖产酸,使伊红和美兰结合而成黑色物,故菌落呈紫黑色(大肠杆菌)或褐色(产气克雷伯氏菌等),前者有时还产生有金属光泽。
表1大肠菌群最可能数(MPN)检
索表
阳性管数
MPN
阳性管数
MPN
1
10-1
10-2
100ml(g
1
10-1
10-2
100ml(g
)
)
0
0
0
<30
2
0
0
90
0
0
1
30
2
0
1
140
0
0
2
60
2
0
2
200
0
0
3
90
2
0
3
260
0
1
0
30
2
1
0
150
0
1
1
60
2
1
1
200
0
1
2
90
2
1
2
270
0
1
3
120
2
1
3
340
0
2
0
60
2
2
0
210
0
2
1
90
2
2
1
280
0
2
2
120
2
2
2
350
0
2
3
160
2
2
3
420
0
3
0
90
2
3
0
290
0
3
1
130
2
3
1
360
0
3
2
160
2
3
2
440
0
3
3
190
2
3
3
530
1
0
0
40
3
0
0
230
1
0
1
70
3
0
1
390
1
0
2
110
3
0
2
640
1
0
3
150
3
0
3
950
1
1
0
70
3
1
0
430
1
1
1
110
3
1
1
750
1
1
2
150
3
1
2
1200
1
1
3
190
3
1
3
1600
1
2
0
110
3
2
0
930
1
2
1
150
3
2
1
1500
1
2
2
200
3
2
2
2100
1
2
3
240
3
2
3
2900
1
3
0
160
3
3
0
2400
1
3
1
200
3
3
1
4600
1
3
2
240
3
3
2
11000
1
3
3
290
3
3
3
≥24000
注:
①本表采用3个稀释度【0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001
g(mL)】、每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)、0.01
g(mL)时,表内数字相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001
g(mL)、0.0001g(mL)时,表内数字相应增加10倍,其余
类推。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 乳制品 微生物 检验 食品 大肠菌 检测