细菌脂多糖的制备与纯化.docx

细菌脂多糖的制备与纯化.docx

《细菌脂多糖的制备与纯化.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌脂多糖的制备与纯化.docx（37页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

细菌脂多糖的制备与纯化

细菌脂多糖的提取与制备

生技052张创峰

指导教师宫强

摘要

目的：

提取制备出鸡白痢细菌的脂多糖（LipopolysaccharidesLPS），并检测出其纯度，免疫动物后检测其诱导机体产生抗体的效价。

方法：

对刚接种的细菌进行37℃培养过夜，此时菌体大致处于对数期。

利用热酚水法提取LPS，通过离心、反复冻融对菌体进行破碎，再透析、浓缩进行LPS粗提取，进而通过酶解、加丙酮沉淀等一系列步骤纯化LPS；然后利用紫外光谱法、标准曲线法和硫酸蒽酮法分别对制备的LPS溶液中核酸、蛋白、糖的含量进行分析测定，配制成适合注射的LPS浓度；最后通过皮下注射免疫鸡，对鸡血进行离心得到血清，保存血清。

免疫三次，采血三次，利用间接Elisa法测定抗体的效价。

结果：

成功提取了细菌的LPS，免疫注射浓度为121.5μg/mL。

未经酶解的粗制LPS于260nm处有强吸收，经酶解处理分离纯化的LPS，于260nm处吸收值较小。

经分光光度计测定，结果为0.324，从标准曲线找出其蛋白含量为0.59mg/mL。

然而所提取的LPS并未使动物产生抗体，免疫动物不成功。

关键词：

鸡白痢细菌，脂多糖（LPS），提取，糖含量，免疫，ELISA

ExtractionandPreparationofSalmonella

Lipopolysaccharide

Grade2005,Class2,MajorofBiotechnologyChuagfengZhang

TutorQiangGong

Abstract

ObjectiveThisstudywastoextractandprepareSalmonellapullorum’sLipopolysaccharides（LPS）,andtestitspurity,afterimmunetheanimals,wewilldetectitsantibodytiterinducedbytheproduction.

MethodsPutthevaccinatedSalmonellaatjust37℃overnighttrain,toensurethebiomassisatlogarithmicphase,andthenextractionofLPSfrombiomasswithmixtureofhotphenol-water,throughcentrifugationandrepeatedfreezingandthawingthebiomasstocarryoutbrokenthebiomass,andthendialysis,dialysisthesolutionforthecrudeLPSextraction,throughthezymohydrolysis,addingacetonetoprecipitateLPS,usingtheultravioletspectroscopy,theBSAstandardcurvemethodandanthrone-sulfuricacidmethodfortestingthecontentofnucleicacids,protein,sugarofthepreparedLPSsolution.Finally,throughthesubcutaneousinjectiontoimmunechicken,toobtainserumfromcentrifugedblood,preservationserum,immunizationthreetimes,bloodthreetimes,selectchickenserumantibodies,usinganindirectElisamethodtodetectthetiterofantibody.

ResultsWesuccessfullyextractedLPSfromtheSalmonella,theconcentrationforimmunizationis121.5μg/mL.WithouttheenzymeinthecrudeLPSthereisstrongabsorptionof260nmbytheenzymetodealwithseparationandpurificationofLPS,inarelativelythereissmallabsorptionof260nmDepartment.Measuredbythespectrophotometer,theresultsis0.324,wecanfindouttheproteincontentis0.59mg/mLfromthestandardcurve.Nevertheless,theextractionofLPSdidnotmakeanimalsgenerateantibodies,theimmuneonanimalsisunsuccessful.

KEYWORDS:

SalmonellaPullorum,Lipopolysaccharides（LPS）,extracts,sugarcontent,immunization,ELISA

外文资料译文

前言

禽细菌病（Salmonellosisavium），即鸡白痢，是一个概括性术语，指由细菌属中的任何一个或多个成员所引起禽类的一大群急性或慢性疾病。

细菌属是庞大的肠杆菌科的一个成员，细菌属包括了2100多个血清型。

在自然界中，家禽构成了细菌最大的单独贮存宿主。

鸡白痢是由鸡白痢细菌引起的鸡的传染病。

本病特征为幼雏感染后常呈急性败血症，发病率和死亡率都高，成年鸡感染后，多呈慢性或隐性带菌，可随粪便排出，因卵巢带菌，严重影响孵化率和雏鸡成活率。

本病可经蛋垂直传播，也可水平传播。

目前，预防鸡白痢普遍采用庆大霉素、痢特灵、氯霉素以及新型喹诺酮类药物，但是，用药物预防需要防止长时间使用一种药物，更不更一味加大药物剂量达到防治目的。

而且需要有效药物在一定时间内交替、轮换使用，药物剂量要合理。

做到这些对于一般的养殖来说是比较困难的。

而生物制剂在防治鸡白痢疾病方面有较好效果，具有安全、无毒、不产生副作用，细菌不产生抗药性，价廉等特点。

经大批量的实验认为，生物制剂防治鸡白痢病的效果多数情况下相当或优于药物预防的水平。

因此，研发预防鸡白痢的新型疫苗势在必行。

而LPS是鸡白痢细菌菌体主要的保护性抗原之一，与外膜蛋白在免疫中共同起着重要的作用。

各项研究的进行以及方法的研究都需要对鸡白痢细菌LPS结构特性及其特异性免疫保护进行研究，因而提取细菌LPS是各项相关工作的第一步，细菌LPS本身目前已成为医学和免疫学的研究热点之一。

因此提取与制备细菌LPS更加必要的。

本文直接通过提取鸡白痢细菌LPS制备抗原，对鸡进行免疫，对于研究预防鸡白痢疾病的疫苗也是有其现实意义的。

本文研究了热酚水法提取脂多糖，通过离心、反复冻融，透析、浓缩、酶解一系列步骤进行纯化，然后利用紫外光谱法、标准曲线法和硫酸蒽酮法分别对LPS中核酸、蛋白、糖的含量进行分析测定，最后通过皮下注射免疫兔子，从兔子血清中获得抗体，利用间接Elisa法测定抗体的效价。

第1章文献综述

1.1鸡白痢简介

鸡白痢（Salmonellosisavium）是由鸡白痢细菌引起的鸡的传染病。

是一种古老而且危害严重的禽类传染病，在世界范围内均有发生，是世界性疾病。

细菌属是庞大的肠杆菌科的一个成员，细菌属包括了2100多个血清型。

在自然界中，家禽构成了细菌最大的单独贮存宿主。

在所有动物中，最常报道的细菌来源于家禽和禽产品。

因此鸡白痢已成为严重影响家禽养殖业的问题之一。

1.1.1病原

鸡白痢是由鸡白痢细菌所引起鸡的一大群急性或慢性疾病。

鸡白痢细菌具有高度宿主适应性。

本菌为两端稍圆的细长杆菌（0.3～0.5um×1～2.5um），对一般碱性苯胺染料着色良好，革兰氏阴性。

细菌常单个存在，很少见到两菌以上的长链。

在涂片中偶尔可见到丝状和大型细菌。

本菌不能运动，不液化明胶，不产生色素，无芽胞，无荚膜，兼性厌氧。

分离培养时应尽量避免使用选择性培养基，因为某些菌株特别敏感。

细菌在下列培养基中生长良好，如营养肉汤或琼脂平板。

在普通琼脂、麦康凯培养基上生长，形成圆形、光滑、无色呈半透明、露珠样的小菌落[1]。

在外界环境中有一定的抵抗力，常用消毒药可将其杀死。

1.1.2传播流行特点

各种品种的鸡对本病均有易感性，以2～3周龄以内雏鸡的发病率与病死率为最高，呈流行性。

随着日龄的增加，鸡的抵抗力也增强。

成年鸡感染常呈慢性或隐性经过。

火鸡对本病有易感性，但次于鸡。

鸭、雏鹅、珠鸡、野鸡、鹌鹑、麻雀、欧洲莺和鸽也有自然发病的报告。

芙蓉鸟、红鸠、金丝雀和乌鸦则无易感性。

一向存在本病的鸡场，雏鸡的发病率在20％～40％左右，但新传入发病的鸡场，其发病率显著增高，甚至有时高达100％，病死率也比老疫场高。

本病可经蛋垂直传播，也可水平传播[2]。

1.1.3病理变化

雏鸡：

在日龄短、发病后很快死亡的雏鸡，病变不明显。

肝肿大，充血或有条纹状出血。

其他脏器充血。

卵黄囊变化不大。

病期延长者卵黄吸收不良，其内容物色黄如油脂状或干酪样；有心肌、肺、肝、盲肠、大肠及肌胃肌肉中有坏死灶或结节。

有些病例有心外膜炎，肝或有点状出血及坏死点，胆囊肿大，脾有时肿大，肾充血或贫血，输尿管充满尿酸盐而扩张，盲肠中有干酪样物堵塞肠腔，有时还混有血液，肠壁增厚，常有腹膜炎。

在上述器官病变中，以肝的病变最为常见，其次为肺、心、肌胃及盲肠的病变。

死于几日龄的病雏，见出血性肺炎，稍大的病雏，肺可见有灰黄色结节和灰色肝变[3]。

成年鸡：

慢性带菌的母鸡，最常见的病变为卵子变形、变色、质地改变以及卵子呈囊状，有腹膜炎，伴以急性或慢性心包炎。

受害的卵子常呈油脂或干酪样，卵黄膜增厚，变性的卵子或仍附在卵巢上，常有长短粗细不一的卵蒂（柄状物）与卵巢相连，脱落的卵子深藏在腹腔的脂肪性组织内[4]。

有些卵则自输卵管逆行而坠入腹腔，有些则阻塞在输卵管内，引起广泛的腹膜炎及腹腔脏器粘连。

可以发现腹水，特别见于大鸡。

心脏变化稍轻，但常有心包炎，其严重程度和病程长短有关。

轻者只见心包膜透明度较差，含有微混的心包液。

重者心包膜变厚而不透明，逐渐粘连，心包液显著增多，在腹腔脂肪中或肌胃及肠壁上有时发现琥珀色干酪样小囊包。

成年公鸡的病变，常局限于睾丸及输精管。

睾丸极度萎缩，同时出现小脓肿。

输精管管腔增大，充满稠密的均质渗出物。

1.1.4检测手段

自19世纪后期，细菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。

此后的60年间，用于分离细菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。

随着DNA和抗体技术的发展，近10～15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出细菌，这些方法通称为快速检测。

最初的是传统的培养方法，是选择性增菌步骤，它使细菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少。

由于没有任何一种培养基可以全面地保持各种细菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。

然后选择性培养物在含一种或多种抑制非细菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。

传统细菌检测法全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果[5]。

然后发展了以抗体为基础的检测方法，利用抗原-抗体反应的显著特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。

已经建立的细菌免疫学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体（ELISA），荧光抗体染色（免疫荧光法），同位素标记抗体（放射免疫试验）为基础的方法及其它多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。

但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法[6]。

此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体，然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。

采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。

黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法（Salmonelletest1）对进出口动物产品（鱼粉、肉骨粉等）进行细菌检测。

总的来说，标准的ELISA法样品的制备，约需要经过40～48h的孵育才能完成。

黎兆滚等人的微量板ELISA法（Salmonellatest1）样品制备过程分三步，共耗时24h比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。

ELISA方法身，则仅需要大约2h而已（其中30min是操作时间，90min是孵育时间[7]）。

相比之下，黎兆滚等人的方法可在27h内完成，比上述方法缩短了一半的时间，颇值得推广应用。

近几年则发展了以核酸为基础的方法，细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。

由于所有的细胞都含有这种分子，可以利用它作为检测的标靶。

标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。

与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素的标识物。

Fitts等人检测极限可达108个细菌/mL，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用，此方法的优点都被抵消了。

为此，以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计目前已发展起来。

这种方法依赖于细菌核糖体RNA（rRNA）—核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。

由于rRNA为单链（而DNA为双链），杂交前需要进行预增菌和选择性增菌。

rRNA探针法比细菌ELISA法更耗时，但二者成本相近。

聚合酶链反应（PCR），用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增，以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。

一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵销了其高敏感性的优点[8]。

1.1.5研究趋势

鸡白痢作为重要的人畜共患病，它的传染和流行不仅严重影响了畜牧业的健康持续发展，而且还威胁着人类的身心健康。

早在20世纪就用青霉素、链霉素、土霉素对其防治，鸡白痢细菌对抗生素药物的敏感性在不断变化，在不同地区，不同场群的药敏情况可有很大不同，所以应经常分离致病菌株，做药敏试验并研究用药途径，以免盲目用药贻误时机，药物防治可有效地控制商品鸡群鸡白痢病的发生。

即往常用于鸡白痢的的土霉素，四环素，磺胺类，青霉素，链霉素等药物在生产实践中的防治作用已很低，甚至完全无效，但庆大霉素，卡那霉素，氯霉素，新霉素肌肉注射，并注意穿梭用药，防治效果非常显著[9]。

但是后来经过大量的试验表明药物防治的区域性太大，所以使人们又希望寻求一种更加高效而又受区域限制小的防治方法。

随着分子生物学技术的不断进步，目前研制的特异性主要有减毒活菌苗免疫预防、灭活菌苗免疫预防、脂多糖抗原免疫预防和高免卵黄液被动免疫，这些疫苗应用免疫保护效果比较显著。

为了更好地防治鸡白痢和有效地实施根除计划，需要进一步对鸡白痢的遗传学和分子流行病学、传播该病的生物种类、病原与宿主复杂的相互作用等进行详细研究。

碳水化合物（如乳糖、甘露糖）可减少鸡白痢细菌在肠道内定居，促进其他肠道菌丛的生长，后者可创造对白痢细菌不利的生长环境，有人用2.5%的5中糖于出壳时饮水，3日于后攻击白痢细菌，10天时扑杀检测白痢细菌的定居数量，结果预防组白痢沙门氏的定居数量明显减少，对照组为100%[10]。

乳糖的作用也可能提高肠道的酸性。

把鸡细菌弱毒苗按不用剂量分别往口服和颈部皮下接种1日龄商品带鸡具有良好的安全性和免疫力。

陈金顶研究，口服抗生素后对集白痢伤寒细菌的定植量明显增多，PH值也显著增高，他认为，抗生素可以破坏生态平衡，是病菌定植的几率增高。

芬兰科学家Nurmi（1973）和Rantala根据他们的研究，首先提出了利用竞争排除方法控制鸡白痢细菌感染的理论及方法，即生物竞争排斥的理论[11]。

一句此理论，近几年为防止鸡白痢，推出了调菌生，调痢生，促菌生，乳康生等各种微生态制剂（活菌生物制剂），对雏鸡口腔滴服的促生长和预防效果显著。

他们无药物残留，不污染环境，符合生态规律，应用前景较为广阔，但仅在环境控制，卫生状况良好的情况下表现较好的防治作用。

给1日龄的雏鸡喂服获喷雾成年健康鸡肠道内容物悬浮液或者厌氧培养物，有效地提高了雏鸡对白痢沙门氏的抵抗力，这被称为Nurmi概念[11]。

1.2LPS研究进展

 一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。

产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌，如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。

另一类为内毒素（Endotoxin），是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构[12]。

细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖（LPS）中的类脂A成分。

LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要组分之一，是菌株血清分型的主要依据，同时协同产Vero毒素的大肠杆菌感染寄主，在发病机制中起着重要作用。

它是鸡白痢细菌菌体主要的保护性抗原之一，与外膜蛋白在免疫中共同起着重要的作用。

1.2.1LPS的来源

细菌菌体裂解后可释放内毒素,日本和我国学者普遍认为内毒素包含脂多糖和蛋白质两部分,而英美学者认为内毒素就是脂多糖。

脂多糖又称细菌内毒素，对其研究已有60多年的历史，作为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要组分之一，是菌株血清分型的主要依据，同时协同产Vero毒素的大肠杆菌感染寄主，在发病机制中起着重要作用[13]。

1909年Coley报道革兰阴性菌具有抗肿瘤效果后，后续研究证明革兰阴性菌细胞壁的结构成分细菌脂多糖，具有抗肿瘤及增强免疫功能等作用[14]。

1.2.2LPS的结构

革兰氏阴性细菌细胞壁较薄，厚约10－15nm,结构也较复杂。

肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。

脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）由多糖O抗原、核心多糖和类脂A（lipidA）组成，位于最外层。

多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性[15]。

核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonicacid，KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。

类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分[16]。

1.2.3LPS提取方法的研究

研究LPS生物活性时，LPS的提取是通过利用有机溶剂分离的经典方法。

经典方法提取LPS包括利用热酚水法（PW），或使用由苯酚、氯仿、石油醚（PCP）组成的混合溶剂从大量生物体中获得[17]。

这两种方法都是基于破坏细菌细胞膜及利用苯酚析出蛋白质，但他们具有不同的选择性。

热酚水法提取光滑型（S）和粗糙型（R）的LPS，而为PCP法主要分离粗糙型LPS。

Darveau和Hancock采用了更少见的方法，用机械方法破坏细菌的细胞，然后利用酶处理，加入SDS或/和EDTA,对提取LPS两种类型（R和S）同样有效[18]。

其他几个可供选择的方法是采用多种有机溶剂，如盐，酸或碱，配合剂或酶，这些都被介绍过[14]。

所介绍的这些方法对于实验室规模是非常有用的，但是扩大提取是很困难的。

这么多的步骤十分费劲，它还会残存有机溶剂、制造毒废物，以至最终产品可能被溶剂残留物所污染。

目前，LPS制剂有越来越多的市场需求，它们需要不含有毒杂质，例如用作免疫学研究或作为疫苗佐剂一种有价值的源泉。

温和的和单步程序制备纯化内部核心抗原决定簇具有特定的免疫决定子粗糙型LPS菌类将是非常重要的，例如脑膜炎球菌。

JacekRybka和PawelGrycko则采用超临界流体二氧化碳（scCO2）进行LPS的提取，scCO2是有害易燃的有机溶剂的安全替代物[19]。

通过压力和温度以及添加少量极性的选择性共溶剂来改变scCO2溶剂属性如密度或疏水性是相对简单的。

该方法能适应特定的需求，如提取高疏水性或高极性物质。

国内外不论是从不同的取材还是用不同的方法来提取脂多糖，都涉及到热酚水法，因而，热酚水法依然广泛使用于脂多糖的提取，秦敏对热酚水法进行了优化处理，改进后用乙醇分级沉淀冷冻离心法所提取的脂多糖较纯，利于后续研究。

周丽蓉用DNaseI酶和RNase酶作用除去DNA和RNA,得到初步纯化的脂多糖，方法简单快速。

冷静用westphal热酚水法对脂多糖进行粗提,阴离子交换层析法进行纯化[20]。

适用于纯化出低相对分子质量高纯度水溶性的成团泛菌脂多糖LPS，为不同分子质量的脂多糖的提纯提供已较好的思路和研究方法。

第2章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与实验动物

细菌43063号菌株购自中国兽药检查所；

成年家养鸡两只购自菜市场。

2.1.2试剂

兔抗鸡IgG-HRP购于北京希凯生物科技有限公司；

RNaseA购于上海生物工程技术服务有限公司；

DNaseI购于北京希凯生物科技有限公司；

考马斯亮蓝R-250购于中国医药（基团）上海化学试剂公司；

聚乙二醇6000购于天津市科密欧试剂公司；

牛血清白蛋白购于上海天呈医流有限公司；

蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉等生化试剂购于北京奥博星生物技术有限责任公司；

苯酚、蒽酮、葡萄糖、氯化钠（NaCl）、冰乙酸、氢氧化钠（NaOH）、乙醇、磷酸等试剂均为国产分析纯。

2.1.3主要溶液的配制

（1）热酚水法提取脂多糖所需试剂

45%酚水溶液：

加55mL去离子水于45mL融化的苯酚溶液中，混匀后室温保存备用。

95%酚水溶液：

加5mL去离子水于95mL融化的苯酚溶液中，混匀后室温保存备用。

（2）O-SP制备所需试剂

1.5%醋酸溶液：

加1.5mL冰乙酸于98.5mL去离子水中，混匀后室温保存备用。

（3）测脂多糖中某些物质含量所需试剂

标准蛋白质溶液：

精确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000mg/mL的原液，混匀后室温保存备用。

考马斯亮蓝G—250试剂：

称取25mg考马斯亮蓝G—250，溶于12.5mL95%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到250mL，混匀后室温保存备用。

标准葡萄糖溶液：

精确称取50mg葡萄糖，溶于500mL蒸馏水中，即为100mg/L的原液，混匀后室温保存备用。

蒽酮试剂：

称取蒽酮0.2g，溶于100mL浓硫酸（AR95%～98%）,使其终浓度为2g/L，混匀后室温保存备用。

（4）ELISA检测测抗体效价所用主要试剂

包被缓冲液：

0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS）

Na2CO3l.59g

NaHCO32.93g

加去离子水水至1000mL，调pH值到9.6。

15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。

磷酸盐缓冲溶液（1×PBS）：

0.01mol/L、pH7.4

NaCl8.0g

KH2PO40.2g

KCl0.2g

Na2HPO4·