完整版海岛棉GbMFT2基因在烟草中的遗传转化毕业设计.docx

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完整版海岛棉GbMFT2基因在烟草中的遗传转化毕业设计

本科毕业论文

海岛棉GbMFT2基因在烟草中的

遗传转化

海岛棉GbMFT2基因在烟草中的遗传转化

学生：

王芳指导老师：

黄先忠

摘要：

已经证明，被子植物共享一个保守的磷脂酰乙醇胺结合（PEBP）结构域来调控开花时间。

PEBP家族包括FT-like，TFL1-like和MFT-like三个亚家族，进化分析表明MOTHEROFFTANDTFL1（MFT）是所有PEBP基因的祖先[10]。

蛋白质序列比对发现GbMFT2蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸，系统进化树分析表明GbMFT2编码产物与拟南芥AtMFT蛋白亲缘关系较近，他们属于同一分支。

用不同浓度的ABA处理棉花种子后GbMFT2基因表达变化明显，表明GbMFT2基因的表达受ABA的调节。

为了进一步研究该基因的功能，将过量表达载体p35S:

GbMFT2叶盘法转化烟草，获得了7株T1代GbMFT2转基因烟草。

种植T2代转基因烟草，发现转基因植株的开花时间均晚于非转基因植株。

并用不同浓度NaCl胁迫处理T2代转GbMFT2基因烟草幼苗，发现转基因烟草的耐盐性明显高于野生型烟草。

进一步分析GbMFT2基因的功能，以便可以利用该基因调节作物的开花时间及耐盐性。

关键词：

PEBP家族；GbMFT2基因；叶盘法；晚花；耐盐

GeneticTransformationofGossypiumbarbadenseGbMFT2intobacco

Abstract:

Angiospermsharingaconservedphosphatidylethanolamine-bindi-

ng（PEBP）domainhavebeenshowntobeinvolvedinthecontroloffloweringtime.Thefamilyisdividedintothreesubfamilies,FT-like,TFL1-likeandMFT-like.EvolutionanalysisshowedthatMOTHEROFFTANDTFL1（MFT）istheancestralformofallPEBPgenesinplant,GbMFT2genehasaPEBPconservedmotif.InconsistencywithalmostallMFT-likeproteins,GbMFT2hasaconservedprolineresidueneartheC-terminussimilaritiessimilarwithAtMFTandtheyallbelongtothesameclade.Exogenousabscisicacid（ABA）ofdifferentconcentrationsresultedinsignificantchangeinGbMFT2expressioningerminatingseeds,indicatingthattheexpressionofthisgeneisregulatedbyABA.Tofurtherstudythefunctionofthegene,Itransformedtheover-expressionvectorofp35S:

GbMFT2intotobacco.7p35S:

GbMFT2transformedtobaccoplantswereacquired.Analysisshowedthatthep35S:

GbMFT2transformedtobaccoshowedlatterflowerphenotypethannon-transgenicwildtypeplants.Besides,throughsalttoleranceanalysisIfoundthatthep35S:

GbMFT2transformedtobaccoshowedstrongersalttolerancethannon-transgenicwildtypeplants.SointhefurtherwecanusetheGbMFT2geneforregulatingthetimeoftheflowersandthesalttoleranceofthecrops.

Keyword:

PEBPfamily;GbMFT2gene;salttolerangce;lateflowering

前言

金鱼草CENTRORADIALIS（CEN）基因的突变造成正常的无限花序被破坏，茎端形成顶花，克隆研究表明CEN蛋白与动物的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine-bindingproteins，PEBP）很相似[1]。

利用CEN基因作为异源探针从拟南芥中克隆了一个同源基因TERMINALFLOWER1（TFL1），tfl1突变体开花提早，顶端分生组织由无限生长变成有限生长，表明TFL1具有维持顶端分生组织无限生长的能力[2]。

FLOWERINGLOCUST（FT）是拟南芥中的一个开花位点的控制基因，FT和TFL1氨基酸序列相似性为71%，二者同属PEBP基因家族[3]。

FT和TFL1蛋白晶体结构分析表明二者高度相似，形成一个包含阴离子结合位点的口袋，口袋入口处的关键氨基酸对于FT和TFL1功能的转变起着重要作用[4]。

TFL1的His88/Asp144在结合口袋的入口处形成氢键，而FT的Tyr85/Gln140不能形成氢键，这在决定蛋白的特定功能上起着关键作用，把这个口袋里的单个氨基酸改变，就可以使FT变成TFL1，相反也是这样[5]。

拟南芥基因组的PEBP基因家族还包括ArabidopsisthalianaCENTRORADIALIS（ATC）、BROTHEROFFTANDTFL1（BFT）、MOTHEROFFTANDTFL1（MFT）和TWINSISTEROFFT（TSF）[6]。

系统进化研究表明，PEBP家族基因主要分为MFT-like，FT-like和TFL1-like3个亚家族，该基因家族成员起着开花促进因子或开花抑制因子的作用。

FT是一个开花促进因子，它整合来自不同途径的信号从而控制开花，已经证明FT蛋白是一个从叶片到顶端分生组织的长距离运输信号，是拟南芥的成花素[11]。

水稻中的HEADINGDATE3a（Hd3a）是拟南芥FT的同源基因，Hd3a蛋白即水稻中的成花激素[7]，Hd3a基因在叶片中表达并通过微管组织运输到顶端分生组织，同成花素受体14-3-3蛋白结合，然后又附着到另一种转录因子OsFD1上形成成花素激活复合体，使开花基因OsMADS15功能活跃起来[8]。

近年来研究发现，除了对开花的控制功能外，FT-like和TFL1-like还涉及到很多不同功能，如马铃薯块茎的形成、茎的伸长、杨树芽的休眠、顶端分生组织生长前的衰减[9]等。

相对于FT-like和TFL1-like基因，MFT-like基因的研究仍然很有限。

进化分析认为MFT是植物PEBP家族基因的祖先[10]。

MFT基因也具有促进开花的作用，但失去功能的mft突变体在正常生长条件下没有明显的表型[9]。

ABA和GA是种子适应外界环境的生物和非生物胁迫调节种子发芽的2个重要的拮抗激素，近年来的研究表明，MFT参与了ABA和GA信号通道在种子发芽过程中起着重要的调节作用[11]。

拟南芥MFT在种子萌发过程中的胚根和下胚轴的转变区特异表达，MFT的转录分别受到ABA信号通道中的2个关键的转录因子ABA-INSENSITIVE3（ABI3）和ABI5的调节，并且DELLA蛋白RGA-LIKE2（RGL2）可以明显地促进MFT的转录。

Hedman等[10]研究发现被子植物MFT-like含有两个亚家族：

A亚家族和B亚家族，A亚家族在双子叶植物和单子叶禾本科植物都存在，B亚家族仅在双子叶植物中存在，在MFT-like基因的进化过程中其中一类MFT-like基因发生了丢失，而A亚家族基因一般羧基末端都含有保守的脯氨酸残基Pro，B亚家族基因一般都含有保守的谷氨酸残基Glu。

棉花是重要的经济作物，开花早晚和产量、品质性状之间存在显著相关，并且影响霜前皮棉产量、纤维长度等。

相对于拟南芥和水稻等植物，棉花的PEBP基因家族的功能研究报道较少。

东锐等[12]从陆地棉中克隆了一个FT-like基因GhFTL1，该基因具有FT-like基因的结构，且在拟南芥中过量表达，长日照下明显的促进早花。

顾超等[13]从棉花中克隆得到了一个MFT类似基因并命名为GbMFT1，用不同浓度的ABA处理棉花种子发现GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。

本研究从海岛棉中克隆得到了一个MFT类似基因并命名为GbMFT2，对棉花种子用不同浓度ABA胁迫，分析GbMFT2的表达情况，发现GbMFT1基因的表达受ABA的调节，此外，将过表达载体p35S:

GbMFT2叶盘法转入烟草，统计转基因烟草与野生型烟草的开花时间，并且进一步探索该基因的功能，对T2代转基因烟草进行盐胁迫处理，对其耐盐性进行分析，为进一步完善棉花PEBP基因家族的功能奠定了基础。

1．材料与方法

1.1实验材料

1.1.1植物材料

普通烟草（Nicotianatabacum）为本实验室保存。

1.1.2菌种、载体及试剂

含有重组质粒p35S:

GbMFT2的甘油农杆菌为本实验室保存；TrisBase、EDTA、CTAB等生化试剂，均购自上海生工生物工程有限公司；10×ExTaqBuffer、2.5mmol/LdNTPMixture、rTaq酶、5×PrimeScriptBuffer、RNaseInhibitor、PrimeScriptTranscriptase均购自TaKaRa公司；Trizol试剂盒购自invitrogen公司；DNA分子量Marker购自东盛公司;所用引物均由北京华大基因有限公司合成。

1.1.3培养基

LB固体/液体培养基：

胰蛋白胨（Tryptone）10g/L；酵母提取物（Yeastextract）：

5g/L；氯化钠（NaCl）10g/L，若配制LB固体培养基需加入15g/L琼脂粉（AgarA）。

若配制LB（Kan+Rif）双抗培养基，则需加入经过过滤灭菌的卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）母液，使其工作浓度分别为50mg/L、25mg/L。

1/2MS培养基：

蔗糖（Sucrose）30.0g/L；MS（Murashige&SkoogMedium）2.2g/L；MES0.5g/L；琼脂（AgarA）8.0g/L。

MS培养基：

蔗糖（Sucrose）30.0g/L；MS（Murashige&SkoogMedium）4.4g/L；MES0.5g/L；琼脂（AgarA）8.0g/L。

烟草培养基：

基本培养基MS（Murashige和Skoog1962），附加不同浓度的植物激素和抗生素，蔗糖含量为3%，琼脂粉含量为0.8%，pH5.8。

具体如表1：

表1植物培养基一览表（mg/L）

培养基类型

编号

6-BA

NAA

Carb

IAA

预培养培养基

MS1

2.0

1.0

选择分化培养基

MS2

2.0

0.1

300

选择生根培养基

MS3

2.0

0.1

300

0.1

1.1.4实验引物

表2引物序列及名称

引物名称

引物序列（5′→3′）

GbMFT2-F

GGGGTACCATGGCTGCCTCCGTTGATCCTCTCG

GbMFT2-R

CGGGATCCTCAACGCCTTCGGCTGACGGGCTCT

GbMFT2-RTF

CTTTGGTGATGACTGACCCTGATGC

GbMFT2-RTR

GTTGGAACAGCACCAGTATGTAGCG

UBQ7F

AGAGGTCGAGTCTTCGGACA

UBQ7R

GCTTGATCTTCTTGGGCTTG

1.2实验方法

1.2.1MFT蛋白序列的比对及分析

登录NCBI网站，通过blastp（）比对获得其他物种的MFT蛋白序列；使用Meg-Align软件，选择ClustalW方法进行比对分析，并保存为.msf格式文件，再用GeneDoc软件进一步分析处理。

1.2.2MFT家族蛋白系统进化树的构建

用MEGA5.10软件构建系统进化树[14]。

蛋白序列比对利用ClustalW程序进行，进化树利用Neighbor-Joining方法构建，其中进行1000次Bootstrap分析以使得分枝的结果更可靠。

1.2.3GbMFT2蛋白三维结构的预测

用同源模建法构建GbMFT2蛋白质三维结构[14]，提交GbMFT2基因所编码的蛋白序列到SWISS-MODEL服务器（）进行自动建模（AutomatedMode），即可得到其同源三维结构，下载其.pdb格式文件，并用Swiss-PdbViewer4.1.0软件进行进一步的构建和分析GbMFT2蛋白质的三维结构以及氢键。

1.2.4p35S:

GbMFT2在烟草中的遗传转化

1.2.4.1烟草种子的处理及萌发

70%酒精消毒2min，再加入20%NaClO消毒7min，水洗3次，最后一次留少量水，用移液器吸出，均匀点种在含有1/2MS培养基的平板上，至于暗培养箱中黑暗培养2天，再放入25℃光照培养箱培养，两个星期后将无菌烟草幼苗的转接到1/2MS培养基上，放入25℃组培室光照培养30天。

1.2.4.2叶盘法转化烟草

（1）将保存的含有重组质粒p35S:

GbMFT2的甘油农杆菌涂板：

取约10μL均匀涂布于含有Kan和Rif的双抗LB固体培养基上，28℃恒温箱培养48h，直至长出单菌落。

（2）农杆菌的活化：

从平板上挑取单菌落，接种到40ml含有Kan和Rif的双抗LB液体培养基上，置于28℃，200rpm摇床上，培养至OD600为0.6-0.8。

（3）活化的农杆菌侵染烟草：

将培养好的农杆菌菌液转入10ml离心管中，4℃，4000rpm离心5min收集菌体；倒去上清，用MS侵染液悬浮菌体，200rpm振荡培养30min；把无菌烟草叶片剪切成1cm2左右的小片放入悬浮液中，200rpm振荡培养浸染15min；取出叶片，用无菌滤纸吸干菌液，置于含有MS1共培养培养基上，28℃培养箱暗培养两天。

（4）MS2培养基上形成愈伤组织：

将暗培养两天后的烟草叶片转入MS2选择培养基上，尽量使烟草愈伤浸入到培养基内部，25℃组培室培养约15天至愈伤形成。

（5）继代培养：

将形成愈伤组织的烟草叶片转入新的MS2选择培养基，培养约两周形成大量的丛芽。

（6）生根培养：

无菌操作的情况下，将侵染烟草叶片的愈伤组织再分化形成的芽用剪刀或镊子取下转入MS3生根培养基中进行生根培养2周。

（7）炼苗和移栽：

将已经生根的烟草和野生型烟草，去掉封口膜，在组培室内炼苗三天；将驯化好的烟草植株，栽培到经过高压灭菌的土：

蛭石=1:

1的营养土里，做好编号，放入植物生长间培养8h光照和16h黑暗的光照培养间里培养。

1.2.5CTAB法提取DNA分子检测转基因植株

（1）取烟草的叶片约1cm2，用研磨棒充分研磨后，每管加入700µLCTAB提取缓冲液，65℃水浴30min，期间震荡3～5次；加入等体积的氯仿，剧烈震荡之后，12000rpm，室温离心10min；取上清，加入2倍体积的异丙醇，-20℃放置2小时，12000rpm，室温离心10min；弃上清，加入0.5mL70%的乙醇洗涤两次，待充分吹干后加入50µLDEPC-H2O溶解DNA，-20℃保存。

（2）PCR扩增时，以叶片的DNA为模板，在20μL的反应体系中加入DNA模板2μL，10×PCRBuffer2μL，dNTPmix（2.5mMeach）2µL，正反向引物（GbMFT2-F/GbMFT2-R，见表2）（10μM）0.5µL，0.2uLrTaqDNA聚合酶，ddH2O补齐。

PCR反应程序为：

94℃，2min，后94℃40s，55℃40s，72℃45s，35个循环后72℃延伸10min。

经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.6棉花GbMFT2基因在ABA胁迫下的表达分析

（1）处理棉花种子：

分别播种在含不同浓度ABA（0、0.5、1、5和10μmolL–1）的1/2MS固体培养基，其成分含有1%的葡萄糖，2.2gL–1MS培养基（DuchefaBiochemieNetherland），0.05%的MES（Amersham,America），0.8%Agar，pH5.8。

将播种后培养皿放入28℃的恒温培养箱内培养，20h胚根已经伸出种壳，此时收集不同处理的棉花种子，并将棉花种子立即浸于液氮中，–80℃保存备用。

（2）提取烟草RNA：

100mg棉花种子经液氮研磨后加入抽提液1ml，65℃水浴10min，其间剧烈震荡2-3次；4℃，12000rpm离心10min后，取上清加入等体积酚：

氯仿：

异戊醇（25:

24:

1），4℃，12000rpm离心15min；取上清，加入等体积的氯仿，1/10体积的5mol/L醋酸钾（pH4.8），1/10体积的无水乙醇，混匀，4℃，12000rpm离心15min。

取上清，加入等体积的氯仿，4℃，12000rpm离心10min；取上清，加入1/4体积的10mol/LLiCl，0℃过夜沉淀；4℃，12000rpm离心15min后，弃上清，质量完好的RNA置于-80℃保存备用。

加入1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2），2.5倍体积的无水乙醇，-70℃，沉淀至少30min；离心4℃，13000rpm离心15min后，弃上清，70%乙醇洗沉淀2次；干燥后用无RNAse的水溶解。

总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）cDNA第一链的合成

参照TaKaRa公司提供的试剂盒将棉花组织总RNA反转录，获得cDNA第一链。

反应物

用量

RNA

4µL

Oligo（dT）18primer（0.5µg/µL）

1µL

DEPC-H2O

1µL

65℃，温育5min，冰上放置2min，再加入以下反应液

反应物

用量

5×M-MLVBuffer

2µL

dNTPMix（10mmol/L）

0.5µL

RNaseInhibitor（20U/µL）

0.25µL

RNaseM-MLV（200U/µL）

0.5µL

（5）半定量RT-PCR分析目的基因的表达情况：

基因特异引物是GbMFT2-RTF和GbMFT2-RTR，内参基因为ubiquitin7，进行半定量RT-PCR。

以UBQ7F和UBQ7R扩增内参，GbMFT2-RTF和GbMFT2-RTR为扩增目的基因的特异性引物。

PCR反应体系（20µL）：

10×PCRbuffer2µL、dNTPmix（2.5mMeach）2µL、引物-F/R（10μM）0.5µL、rTaq（5U/µL）0.2µL。

程序：

94℃预变性4min;94℃30s,55℃45s，72℃40s后扩增（内参基因扩增28Cycles，GbMFT2扩增30Cycles）；72℃延伸10min。

1.2.5T2代转基因烟草表性分析

1.2.5.1T2代烟草种子的处理及种植

70%酒精消毒2min，再加入20%NaClO消毒7min，水洗3次，最后一次留少量水，用移液器吸出，均匀点种在含有200mg/LKan的1/2MS筛选培养基上。

至于暗培养箱中黑暗培养2天，再放入25℃光照培养箱培养，两个星期后将幼苗分为两部分：

一部分无菌烟草幼苗的转接到分别含0mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L的1/2MS培养基上盐胁迫处理30天，观察表型；将另一部分野生型烟草与转基因烟草种在含1/2MS的锥形瓶，光照培养箱中培养30天，再经过两天的炼苗后栽培到经过高压灭菌的土：

蛭石=1:

1的营养土里，做好编号，放入h光照和16h黑暗的培养间里培养，统计转基因烟草与野生型烟草的开花时间。

1.2.5.2CTAB法提取T2代转基因烟草的DNA进行的分子检测

（1）取烟草的叶片约1cm2，用研磨棒充分研磨后，每管加入700µLCTAB提取缓冲液，65℃水浴30min，期间震荡3～5次；加入等体积的氯仿，剧烈震荡之后，12000rpm，室温离心10min；取上清，加入2倍体积的异丙醇，-20℃放置2小时，12000rpm，室温离心10min；弃上清，加入0.5mL70%的乙醇洗涤两次，待充分吹干后加入50µLDEPC-H2O溶解DNA，-20℃保存。

（2）PCR扩增时，以叶片的DNA为模板，在20μL的反应体系中加入DNA模板2μL，10×PCRBuffer2μL，dNTPmix（2.5mMeach）2µL，正反向引物（GbMFT2-F/GbMFT2-R，见表2）（10μM）0.5µL，0.2uLrTaqDNA聚合酶，ddH2O补齐。

PCR反应程序为：

94℃，2min，后94℃40s，55℃40s，72℃45s，35个循环后72℃延伸10min。

经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.5.3分析不同浓度NaCl对T2代转基因烟草叶片叶绿素含量的变化

（1）烟草叶片的盐胁迫处理

称取新鲜样品0.2g左右，擦净组织表面污物。

分别放入0mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/LNaCl的溶液中。

至于光照培养间，放置72h。

（2）测定叶绿素a和叶绿素b的含量

将72h盐处理后的叶片剪碎，分别放入研钵中，加少量石英砂和2mL95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。

静置3～5min。

取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。

直至滤纸和残渣中无绿色为止。

最后用乙醇定容至25mL，摇匀。

把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。

以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

将测定得到的吸光值代入下面的式子：

Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。

据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：

mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。

最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：

叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重。

1.2.5.4统计不同浓度N