试验三培养基的制备及灭菌安徽建筑大学.docx
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试验三培养基的制备及灭菌安徽建筑大学
《环境工程微生物学实验》
实验指导书
鲍立宁编写
适用专业:
环境工程
安徽建筑大学环境与能源工程学院
2017年9月
前言
《环境工程微生物学实验》是环境工程专业的必修课。
本课程是培养学生基本技能、训练实践技能的一个重要教学环节,通过实验使学生对环境工程中的微生物学原理有一个深入的认识,从而更深刻地理解和掌握专业基本理论和基本知识,并且为日后深入研究污水监测、处理技术提供一种实践技能。
通过本课程学习使学生掌握微生物学实验的基本原理、基本知识和基本实验技能;掌握显微镜的使用、保养,饮用水的卫生细菌学检查,微生物的基本形态认识及微生物的培养、分离、染色、计数等基本技能,培养学生独立操作能力;树立理论联系实际的基本思想,养成良好的动手能力,增强创新能力。
本课程共设十三个实验,其中显微镜的使用及放线菌、真菌、藻类等微生物形态的观察活性、污泥中原生及微型后生动物的观察和数量的测定、培养基的制备及灭菌、细菌淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定、大肠杆菌生长曲线的测定为验证性试验;空气中微生物的检测、水中细菌菌落总数(CFU)的测定、水源水中粪便污染指示菌的检测—多管发酵法为综合性实验;环境中特殊微生物的分离、筛选及鉴定为研究性试验。
本指导书适合于环境工程专业本科教学,也适用于环境工程辅修专业的学习。
实验一显微镜的使用及微生物形态的观察
实验学时:
2学时
实验类型:
验证
实验要求:
必修
一、实验目的
1.学习普通光学显微镜的使用方法(本实验学习低倍镜和高倍镜的使用)。
2.观察霉菌、酵母菌、放线菌、藻类的形态和构造。
二、实验器材
1.显微镜、载玻片、盖玻片等。
2.示范片
三、实验步骤
(一)显微镜的结构和各部分的作用
图8-1所示,是微生物检验常用的显微镜,其构造分机械和光学两部分。
机械部分主要包括:
1.镜筒镜筒长度一般是160mm。
它的上端装有接目镜,下端有回转板。
回转板上一般装有3个接物镜。
2.载物台载物台是放置标本的平台,中央有一圆孔。
使下面的光线可以通过。
两旁有弹簧夹,用以固定标本或载玻片。
有的载物台上装有自动推物器。
3.调节器镜筒内旁有两个螺旋,大的叫粗调节器,小的叫细调节器,用以升降镜筒。
调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。
光学部分主要包括:
1.接目镜一般使用的显微镜具有2~3个接目镜,其上常刻有“5×”、“l0×”或“15×”等数字及符号,意即使用时可放大5倍、l0倍或15倍。
观察微生物时常用放大l0倍或15倍的接目镜。
2.接物镜接物镜装在回转板上,可分低倍镜、高倍镜和油镜3种,其相应的放大倍数常是10、40、l00。
通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。
例如,用放大40倍的接物镜(高倍镜)与放大10倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为40×10=400,如果用放大15倍的接目镜则放大倍数为40×15=600。
接目镜装在镜筒上端,在使用过程中并不经常变动,所以通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。
油镜的放大倍数最大(100倍)。
放大倍数这样大的镜头,焦距就很短,直径就很小,所以自标本玻片透过的光线,因介质密度(从玻片至空气,再进入油镜)不同,有些光线因折射或全反射,就不能进入境头,致使射入的光线较少,物象显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失,须在油镜与玻片中间加入和玻璃折射率(n=1.52)相仿的镜油(香柏油,n=1.515)。
因为这种接物镜使用时须加镜油,所以我们称它为油镜(图8—2)。
一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油,所以也称干镜。
使用低倍镜和高倍镜时,一般作活体的观察,不进行染色。
在观察细小动物时,低倍镜主要用来区别动物的种类和看出它们的活动状态,而高倍镜则可看清动物的结构待征,低倍镜容易看到标本的全貌,油镜在大多数情况下是用来观察细菌染色的涂片。
3.集光器集光器在载物台的下面,用来集合由反光镜反射来的光线。
集光器可以上下调整,中央装有光圈,用以调节光线的强弱。
当光线过强时,应缩小光圈或把集光器向下移动。
4.反光镜反光镜装在显微镜的最下方至集光器。
(二)显微镜使用和保护的方法
1.低倍镜的使用法
(1)置显微镜于固定的桌几上,窗外不宜有障碍视线之物。
(2)拨动回转板,把低倍镜移到镜筒正下方,和镜筒连接而对直。
(3)拨动反光镜向着光线的来源处,同时用眼对准接目镜(选用适当放大倍数的接目镜)仔细观察,使视野完全成为白色,这是光线已经通到镜里的表示。
(4)把载玻片放到载物台上,要观察的标本放到圆孔的正中央。
(5)将粗调节器向下旋转,同时眼睛注视接物镜,以防接物镜和载玻片相碰。
当接目镜的尖端距载玻片约0.5cm时停止旋转。
(6)把粗调节器向上旋转,同时左眼向接目镜里观察。
如标本显出,但不十分清楚,可用细调节器调节,至标本完全清晰为止。
(7)假如因旋转粗调节器太快,致使超过焦点,标本不能出现时,不应在眼睛注视接目镜的同时向下旋转粗调节器,必须从第(5)步做起,以防因没有把握的旋转,使接目镜与载玻片碰触。
(8)在观察时,最好两眼都能同时睁开一面看一面画出所看到的物象。
2.高倍镜的使用法
(1)使用高倍镜以前,先用低倍镜检查,把要观察的标本放到视野正中。
(2)拨动回转板使高倍和低倍两镜头互相对换。
当高倍镜移动到载玻片时,往往镜头十分靠近载玻片。
这时必须注意是否因高倍镜靠近的缘故而使载玻片也随着移动。
如果载玻片有移动的现象,则应立刻停止推动回转板,把高倍镜退回原处,再按照使用低倍镜的方法,校正标本的位置,然后旋动调节器,使镜筒稍微向上,再对换高倍镜头。
(3)当高倍镜已被推到镜筒下面时,向镜内观察所显现的标本,往往不很清楚,这时可旋转细调节器,上下移动,但不要过分移动。
3.油镜的使用方法
(1)如用高倍镜放大,倍数还不够,则须采用油镜。
用油镜以前,先用高倍镜检查,把要观察的标本放到视野正中。
(2)用油镜时,在载玻片上加一滴镜油,然后拨动回转板对换高倍镜和油镜,使油镜头尖端和油接触,而后向接目镜观察。
假如不清晰,可稍微转动调节器,但切记不要用粗调节器。
(3)用过油镜后,必须用擦镜纸或软绸将载玻片和油镜所粘着的油拭净。
必要时,可略蘸二甲苯少许,揩拭镜头,最后用擦镜纸或软绸擦干。
4.显微镜的保护法
(1)显微镜应放置在干燥的地方,使用时须避免强烈的日光照射。
(2)接物镜或接目镜不清洁时,应当用擦镜纸或软绸揩擦。
(3)用完显微镜后,应当立即放到镜匣中。
(四)示范片的观察
1)在选定的接目镜下,先利用低倍镜所制备的微生物标本玻片,画出所见原生动物、菌胶团等微生物的形态草图。
记下观察所用接目镜和接物镜的放大倍数和算出显微镜的放大倍数。
2)改用高倍镜观察,画出微生物的形态草图,并与用低倍镜所看到的比较,注意其不同点。
记下显微镜的放大倍数。
四、实验作业
分别绘制各种微生物的镜下形态图(至少8张)。
五、思考题
使用显微镜时,哪些地方需特别注意?
实验二活性污泥中原生及微型后生动物的观察和数量的测定
实验学时:
2学时
实验类型:
验证
实验要求:
必修
一、实验目的
观察活性污泥法曝气池混合液中原生及微型后生动物的状态,辨别其种类,并测定每种微型动物的数目。
二、实验器材
1.活性污泥法曝气池混合液。
2.显微镜、小量筒、滴管等、载玻片、盖玻片。
三、实验步骤
1.将活性污泥法曝气池混合液轻轻搅拌均匀;如混合液较浓,则可稀释成1:
1的液体(稀释方法:
取l0ml量筒一个,加混合液5ml再加蒸馏水5ml,搅拌均匀,即成1:
1稀释液)。
2.取洗净的滴管一支(滴管每滴水的体积应预先标定,一般每一滴水的体积约为l/20ml),吸取混合均匀的曝气池混合液或已稀释的混合液,滴1滴在载玻片的中央,以盖玻片(以方形为好)轻轻盖上水滴,要避免盖玻片内形成气泡。
3.用低倍显微镜进行计数计数时,先将视野放在盖玻片的右上角(可根据各人的习惯),然后移动玻片,视野即可随之从上而下、从左而右通过。
当前一个视野数完,并做好记录后,再换第二个视野,如此往复将整个盖玻片下面的动物全部计数完毕。
注意在调换视野时,不可使相邻的视野重叠或遗漏。
然后换算成1ml混合液中的动物数。
4.计算设在一滴水中测得钟虫30只,则每ml混合液中含有钟虫30×2×20=1200只,如测得轮虫10只,则每毫升混合液含轮虫10×2×20=400只(如滴管每一滴体积为1/20ml,所观察的液体是1:
l稀释的曝气池混合液)。
注意事项:
1)生物滤池和生物转盘上的生物膜形成胶状,浓度大,一般都必须稀释后计数,其适当的稀释比可在实践中摸索。
2)上述计数方法仅适用于原生动物和轮虫,对个体较大的微型动物和线虫等,则须加大计数容量,以免造成误差。
3)为了避免微生物游动而影响计数,可用接种环加一环氯化汞(HgCl2)饱和溶液以杀死微生物。
四、实验作业
按下表记录实验结果。
动物名称
每滴稀释液中的虫数
每ml混合液中的虫数
状态描述
五、思考题
观察活性污泥中原生动物的种类和数量在实际污水处理中有何意义?
实验三培养基的制备及灭菌
实验学时:
4学时
实验类型:
验证
实验要求:
必修
一、实验目的
1.学会玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。
2.掌握培养基配制和无菌水制备的方法。
3.学会高压蒸汽灭菌技术。
二、实验器材
1.培养皿(又称平皿,直径90mm)、试管、吸管、锥形瓶、烧杯等。
2.纱布、棉花、报纸、牛皮纸。
3.pH试纸6~8.4(或pH电位计或氢离子浓度比色计)、洗液、10%HCL、10%NaOH。
4.牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水。
5.高压蒸气灭菌器、烘箱、冰箱、电炉等。
三、实验内容
(一)玻璃器皿的洗刷与包装
1.洗刷玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。
培养皿、试管、锥形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷,然后用自来水冲洗。
吸管则先用洗液浸泡、再用水冲洗。
洗刷干净的玻璃器皿应放在烘箱中烘干。
2.包装
(1)培养皿由一底一盖组成一套,按实验所需的套数一起用牛皮纸包装。
(2)吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花,构成1~1.5cm长的棉塞,以防止细菌吸入口中,并避免将口中细菌吹入管内。
棉花要塞得松紧适宜,吸时既能通气,又不致使棉花滑入管内。
将塞好棉花的吸管的尖端,放在4~5cm宽的长纸条的一端,吸管与纸条约成45°交角,折叠包装纸包住尖端,用左手将吸管压紧,在桌面上向前搓转,纸条即螺旋式地包在管子外面,余下纸头折叠打结,按照实验需要,可单支包装或多支包装,以备灭菌。
培养皿和吸管也有放在特制容器内进行灭菌的。
(3)试管和锥形瓶等的管口或瓶口均需用棉花塞堵塞。
做好的棉塞,四周应紧贴管壁和瓶口,不留缝隙,以防空气中微生物会沿棉塞皱折侵入。
棉塞不宜过松或过紧,以手提棉塞,管、瓶不掉下为准。
棉塞的2/3应在管内或瓶口内,上端露出少许,以便拔塞。
在制作培养基的过程中,如不慎将棉塞沾上培养基时,应用清洁棉花重做。
待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包裹,并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内(用纸包裹是为了避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞),以备灭菌。
(二)培养基的制备
1.步骤
(1)配制溶液按培养基的配方,称取各种原料。
取适量的烧杯盛所需水量,依次将各种原料加入、溶解。
难溶的原料如蛋白胨、牛肉膏、琼脂等需加热溶解,当原料全部溶解后应加水补充因蒸发损失的水量。
加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。
(2)调整pH值用pH试纸(或pH电位计或氢离子浓度比色计)测定培养基溶液的pH值,加酸或加碱调至适宜pH值。
(3)过滤用纱布、滤纸或棉花过滤均可。
如
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