质粒的复制复制子.pptx

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,第五章质粒（plasmid）,质粒：

是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自我复制的遗传因子。

a、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体）b、质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA（covalentclosedcircularDNA，简称cccDNA）c、分子大小范围从lkb左右到1000kb。

应用：

以质粒为载体进行基因克隆以及在原核和真核生物中表达外源蛋白。

第一节质粒的发现和命名,一、质粒的发现,大肠杆菌的F因子是第一个被发现的细菌质粒（1946）。

在以后的20多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。

70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。

二、质粒的命名原则,质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和,性差异划分为不同的类型。

最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名：

F因子（fertilityfactor，致育因子）R质粒（resistancefactor，抗性质粒）Col质粒（colicin，大肠杆菌毒素质粒）,质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成。

第一个字母一律用小写p表示；后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写；编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒。

pUC18和pUC19,命名原则（1976）：

第二节质粒的遗传特征,一、质粒的大小和拷贝数质粒的大小：

一般在1-200kb，最大的可达1400kb（如苜蓿根瘤菌质粒pRm141a）。

质粒的拷贝数：

是指同一质粒在每个细胞中的数量，不同的质粒在同一细胞中的拷贝数有差异。

一般而言，质粒的拷贝数与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子质量小的拷贝数高。

根据其拷贝数分为：

严谨型质粒（Stringentplasmid）,松弛型质粒（Relaxedplasmid）严谨型质粒：

质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制同步进行。

其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。

如F质粒。

松驰型质粒：

质粒的复制与染色体复制不同步。

通常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。

质粒大小和类型,二、质粒的复制,复制子（replicon）是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。

大肠杆菌染色体的复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。

质粒,复制子,拷贝数,几种常见质粒载体所携带的复制子,革兰氏阴性细菌中多数质粒以型方式复制,1.质粒复制的方式,质粒型复制示意图,质粒滚环复制示意图,质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，而复制所需要的其他蛋白都是利用寄主的复制酶体系。

在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。

2.复制起点（ori）区的功能,ori区是质粒复制所必需的。

ori区决定质粒的寄主范围。

分子克隆中常用的质粒载体构建方法：

将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上，并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。

在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于ori序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA序列是复制所必需的。

有些质粒如ColEl类型的质粒具有较窄的寄主范围，只在E.coli及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆菌中复制。

一些从G+细菌中分离的滚环复制的质粒属于广寄主范围质粒，能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。

质粒的寄主范围通常是由ori区决定的。

质粒不相容性：

是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相对减少。

这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。

一般来说，同一类型的质粒是不相容的，而不同类型的质粒则是相容性的。

第三节质粒的不相容性和质粒的类群,由于性状相近的质粒通常具有相同或相似的复制调控机制，其阻遏物（抑制物或重复序列）亦相似，在调控时，它们也能随机地与其中的任一质粒的复制区结合而阻遏了其复制过程，并进而使之在子代细胞中丢失。

质粒不相容性机制：

因此，也可以根据复制子是否相同来划分质粒的不相容群。

携带有相同复制子的不同质粒属于同一不相容群，它们不能共存于同一细菌中。

带有不同复制子的质粒属于不同的不相容群，它们可以共存于同一细菌中。

ColIb-P9,R144,R483,R64,R621a,R69,R46,R16,R466bR15,N3,pKM101R723,RP1,RP4,R68,R751,R690,RK2,RSF1010,pKT212,pKT230,pGSS,革兰氏阳性细菌,R7K,R388,pSA747R6KpT181,pC221,pS194,pC223,pUB112,pE194,IncIIncMIncNIncOIncPIncQIncWIncXpT181pUB110pSN2,pBC110,pBC16pSN2,pE12,pIM13,要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下面两个方面的条件：

1、每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；2、当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配到两个子细胞中去。

在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞的途径可分为：

主动分配（activedistribution）随机分配（randomdistribution）,第四节质粒的稳定性（细胞分裂中的质粒分配）,sopB,sopC,SopA,SopB,sopA和sopB反式作用基因,sopC:

顺式作用位点,12个43bp的正向重复序列,SopB与sopC区结合，形成蛋白-核酸复合物，该复合物参与质粒的分配。

在F质粒中，par区由sopA和sopB两个基因及sopC区组成,GGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGGTCCCACTCGTATCGTCCCAGACTAATAATCAGACCCTGGTGCCAGGGTGAGCATAGCAG有一对7bp的反向重复序列,1.主动分配（activedistribution）机制,SopA蛋白与sopAB转录单位的启动子区的操纵基因结合，对其转录进行调控；,SopB蛋白虽不能与sopAB操纵子的启动子结合，但它能促进SopA蛋白的结合能力。

因此，SopB蛋白必须维持在适当的浓度，才能保证F质粒在细胞内的稳定性。

复制,质粒分配,细胞分裂,质粒,分配复合体,复制体,细菌质粒DNA的分配模型图,质粒DNA在位于细胞中央的复制体（replisome）的作用下进行复制。

质粒复制后，分配蛋白与sopC位点结合形成分配复合物。

复制后的质粒均等地分配到两个子细胞中，分配后的质粒可能在分配蛋白的作用下，定位于细胞的特定区域。

随机分配：

是指在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。

2.随机分配机制（randomdistribution）,人工构建的质粒载体在构建过程中并不携带par区，因此它们在细胞分裂过程中是被随机分配的。

尽管在大肠杆菌培养物中出现无质粒细胞的可能性较低，但在一定的条件下，如培养基耗尽或是寄主细胞快速生长分裂的过程中，仍有可能产生出无质粒的细胞。

因此，人工构建的质粒载体，都必须具有选择性遗传标记如：

抗药性、营养缺陷型等，以保持选择压力。

IncP、IncN、IncQ、IncW组的质粒属于广寄主范围质粒（broadhostrangeplasmid）。

广寄主范围质粒：

指质粒能通过接合作用转移到很多不同种甚至不同属的寄主内，并能稳定地存在于这些寄主细胞内。

下面以IncP为例对这一类质粒进行介绍,第五节IncP组质粒的特征和接合转移,1.IncP质粒的特征,IncP组的质粒的寄主较广，IncP质粒自身或带动其他质粒能从大肠杆菌转移到几乎所有的G-细菌中，有研究表明IncP质粒还能接合转移到G+细菌、酵母、植物细胞中。

大肠杆菌IncP组包括很多种天然质粒，大小在60-90kb，具有多种抗性基因，如：

卡那霉素（Kan）、四环素（Tet）、氨苄青霉素（Amp）、链霉素（Str）、氯霉素（Cam）、庆大霉素（Gen）等。

RP4质粒的酶切和遗传图谱,oriV：

质粒的营养复制区,tra基因和oriT位点：

与接合转移有关含有抗性基因,2.接合转移质粒的应用,从理论上讲，可移动质粒只要含有与自主转移质粒相同的oriT位点就能被转移。

对自然界中不能自主转移的质粒，可人工加上oriT位点，然后诱动其转移。

构建广寄主范围的质粒载体：

根据自主转移质粒能自主转移及其能带动可移动质粒的转移这两个特征而设计的。

第五章：

质粒,1、试述质粒在现代生物学研究和应用中的作用和意义？

2、何谓严谨型质粒、松弛型质粒？

划分依据是什么？

3、简述质粒不相容性的作用机理？

4、质粒稳定性遗传，至少需要满足何种条件？

5、在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞中去的途径有哪些？