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微囊藻毒素提取及其生物降解研究
微囊藻毒素的提取及其生物降解研究
水质下降、水体环境污染和富营养化问题日趋严重,特别是蓝藻水华问题在淡水湖泊的频繁爆发,已引起全球的关注。
在蓝藻死亡后,其细胞裂解,并向环境介质中释放多种不同类型的微囊藻毒素(MCs),对人类产生危害。
因此需要建立快速、灵敏、稳定、高效的方法对环境介质中的微囊藻毒素进行定性、定量分析。
同时,需要进一步研究其生物降解机理,对已爆发蓝藻问题的水域进行治理。
本论文在比较有关研究蓝藻、微囊藻毒素研究的基础上,进一步验证和探究微囊藻毒素MC-LR的提取、纯化以及分析检测条件。
优化了固相萃取(SPE)结合高效液相色谱法(HLPC)分析水中的MC-LR的方法,主要确定了20%的甲醇为淋洗液、含有0.06%三氟乙酸(THF)的纯甲醇为洗脱液的MC-LR的SPE提取条件。
并初步探究了漆酶、锰过氧化物酶对不同浓度MC-LR的降解作用。
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关键词微囊藻毒素、固相萃取、高效液相色谱、锰过氧化物酶
TitleStudyontheextractionandbiodegradationofmicrocystins
Abstract
Thedeteriorationofwaterquality,seriousenvironmentalpollutionandeutrophication
ofwater,especiallythehighfrequencyofalgalbloominfreshwaterlakes,hasattracted
globalattention.Afterthedeathofthecyanobacteria,thecellssplitandreleasevarious
typesofmicrocystins(MCs)totheenvironmentalmedia,whichareharmfultohuman
beings.Therefore,it’sneededtoestablisharapid,sensitive,stableandefficientmethod
forqualitativeandquantitativeanalysisofMCsinenvironmentalmedia.Atthesame
time,afurtherstudyonitsbiodegradationmechanismisrequired,whichisusedfor
controllingalgalbloominlakes.
OnthefoundationofthestudiesavailableoncyanobacteriaandMCs,the
3.3.2实验仪器13
3.2.3MC-LR的分析检测.13
3.4漆酶对MC-LR的降解15
3.4.1实验材料15
3.4.2降解实验15
3.5锰过氧化物酶对MC-LR的降解16
3.5.1实验材料16
3.5.2降解实验16
4结果与讨论..16
4.1淋洗液浓度的选择.16
4.2洗脱液浓度的选择.18
4.3三氟乙酸(THF)浓度的选择..19
4.4漆酶对不同浓度的MC-LR的降解..19
4.5MnP对不同浓度的MC-LR的降解.20
结论22
致谢23
参考文献..24
1绪论
近些年来,由于许多自然和人为因素的影响,排入湖库的氮、磷等营养物质
不断增加,致使水体富营养化状况加剧,进而导致各地水体蓝藻水华的暴发越来
越频繁,规模也越来越大。
严重的水华会覆盖水面,阻止水体中的光合作用及其
与大气的交换,使水中的溶解氧浓度迅速降低,造成水生动植物的死亡以及生态
和周边环境的破坏。
这些影响又进一步对周边城市的政治经济产生严重破坏,如
投资业、水产业、旅游业。
同时,藻华常使水体中的藻毒素含量严重超标,这些
藻毒素也是肝脏肿瘤等疾病的强诱发剂,严重威胁着人体健康和饮用水安全。
本
章参考了相关研究以及报道,主要介绍了蓝藻水华污染的现状、爆发、危害和防
治,同时简述了微囊藻毒素的研究进展,为进一步研究微囊藻毒素提供了较为深
入的理论基础。
1.1蓝藻水华的现状、危害及防治
,导致水生浮游动物、鱼类以及水生植物因缺氧或中毒而死亡。
(2)危害人类及其它动物的健康。
蓝藻能产生各种各样的天然毒素,主要是
环肽、生物碱和脂多糖内毒素,上述毒素的致毒类型包括肝毒性、神经毒性、遗
传毒性、皮炎毒性等[4]
,其中以肝毒性的微囊藻毒素危害最大。
另外在水生动物
体内积累的藻毒素包括鱼、贝和浮游动物等,有可能通过食物链的累积效应从而
危害人体及动物的健康。
(3)破坏水域生态景观。
当蓝藻水华暴发时,水体水面被厚厚的蓝藻水华所
覆盖,水体透明度下降,颜色变绿,加之死亡的浮游生物和鱼类漂浮在其中,不
仅使原来干净、清澈、透明的水体变得色泽混杂,浮游藻类死亡后沉入水底并堆
积使水体变浅,加速了湖泊、水库的沼泽化进程,破坏了原有的生态景观。
1.1.3蓝藻水华的防治
国内外学者对蓝藻水华的控制进行了探究,根据其除藻机理,可分为以下几类:
(1)化学法。
即用化学药物灭杀的方法,如松香胺类、三连氮衍生物、有机
酸、醛、酮以及季胺化合物等有机物和铜盐(硫酸铜、氧化铜)、高锰酸钾磷的沉盐等)、氯气、臭氧、漂粉精等无机物[5]。
其中硫酸铜是应用最
为广泛的杀藻剂。
(2)机械清除法。
采用重力振动、旋振和离心等方法将藻类收集起来,并使
之与湖泊介质分离[6]。
(3)营养控制法。
调节营养盐的输入,主要是控制磷的输入[7]。
(4)曝气混合法。
通过机械混合或曝气破坏水层。
(5)水动力学控制法。
如通过增加湖水流量来减少滞留时间。
(6)生物控制法。
采用经典、非经典生物操纵法及微生物杀藻技术等方法来
性肠胃炎。
1996年,在巴西Caruaru市一所血透析医院的肾透析治疗中心,由于
误用了被MCs污染水作为透析用水,结果导致116人中毒、52人死亡,该事件
在国际上引起了极大震惊[10]
。
如果人们经常接触含有毒素的水体,MCs还会诱
发人患肝炎并促发肝癌。
总体说来MCs引发的人类急性中毒症状也是多种多样,以肠胃炎最为常见,
其次是肝损伤和呕吐等症状。
同时为了保证人类饮用水的健康安全,1998年国
际卫生组织(WHO)推荐了饮用水中MCs含量的允许标准为1μg/L。
该标准在当
时只被少数国家接受,后来越来越多的国家接受了这个标准。
在2001年,我国
卫生部也接受了这一标准。
1.2.3微囊藻毒素的分析检测
(1)高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HLPC)
HLPC法是检测MCs常用的方法之一,它检测准确度高,结果的重现性好。
MCs的最大紫外吸收波长为238nm,利用二极管阵列紫外光检测器可获得更多
MCs的光谱信息,与MCs的标准品进行对照。
但是由于MCs都显示相似的紫外
光谱特征,所以二极管阵列紫外光检测器对MCs的定性鉴定能力是有限的。
分析中采用的固定相和流动相对样品中MCs单体的分离影响很大。
等度洗脱
和梯度洗脱都能够将MCs单体分离。
目前广泛应用的高效液相色谱法采用反相
C18色谱柱,以含有0.05%的三氟乙酸的乙腈溶液和含有0.05%的三氟乙酸的水
溶液进行梯度洗脱。
三氟乙酸作为离子配对剂能够调节流动相的极性,达到更好
的分离目的[11]。
(2)薄层色谱法
薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术,薄
层色谱法设备要求低,操作简单、方便、快速,具有较好的灵敏度。
以及金属离子等条件下,对MCs有明显的降解活性。
通过16SrDNA的序列分析,
该菌与吉氏库特菌的相似性达99%。
目前,很多研究是关于固定化降解菌用于去
除微囊藻毒素,其中陈晓国等人[16]
研究表明用海藻酸钠固定化细菌的可在适当
条件下4天内将初始浓度为4.1mg/L的MC-LR降解到检测限以下。
目前报道的微囊
藻毒素降解菌有鞘氨醇单胞菌、铜绿假单胞菌和青枯菌。
(3)缺氧及厌氧性MCs降解菌
实际上缺氧和厌氧微生物在MCs的生物降解过程中同样发挥着重要作用。
吕
锡武研究了好氧和缺氧条件下,序批式生物膜反应器对有毒蓝藻及其藻毒素的去
除[17]
。
结果表明,在缺氧条件下对MCs亦有降解作用,但效率比好氧条件下低
许多。
此外,陈晓国等人通过研究滇池沉积物种的混合菌在厌氧条件下对
MC-LR的降解能力表明该菌具有较强的降解能力,并且可以利用MC-LR作为唯
一氮源。
由此可见,在特定环境中,如溶解氧浓度较低的深水和沉积物中,厌氧
生物降解可能是MCs去除的一个重要机制。
1.3漆酶的结构与应用
漆酶(Laccases)是一种结合多个铜离子的蛋白质,属于铜蓝氧化酶,也称为
对苯二酚氧化酶。
漆酶蛋白一般由500-550个氨基酸构成[18]
。
不同来源的漆酶其
氨基酸序列相似性并不高。
漆酶催化机制比较复杂,不同的反应有不同的机理,但共同的一点是漆酶催
化苯酚类、芳香胺和其它富含电子的底物单电子氧化,同时将氧分子还原成水。
在这一过程中,漆酶从被氧化的底物分子中提取一个电子,使之形成自由基,该
自由基不稳定,可进一步发生聚合或解聚反应。
而漆酶催化底物氧化和对O2的还
原是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的。
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- 微囊藻 毒素 提取 及其 生物降解 研究