Roche LightCycler 480 中文操作说明要点.docx

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RocheLightCycler480中文操作说明要点

LightCycler®480中文操作说明

罗氏医学仪器公司/应用科学部门

February2008

一.启动机器与软件

3

二.软件设定---开启新实验

5

三.样品编辑

9

四.结果分析

12

五.报告

18

六.数据转移至其它计算机（数据输出与输入）

19

七.使用者管理

19

一．启动机器与软件

∙启动机器

1.机器主开关位于机器右后方。

2.机器正面两个警示灯代表机器状态。

待警示灯（右）由闪烁橘色灯转变成稳定橘色灯，警示灯（左）由橘色转变成绿色（约三分半钟），表示机器已经启动完成。

左警示灯

右警示灯

机器状态

橘*闪烁*

橘*闪烁*

正在初始化

绿

橘

机器启动完成

96/384孔盘还未放入

绿

橘*闪烁*

96/384孔盘正在放入中

绿

绿

机器启动完成

96/384孔盘已经放入

绿*闪烁*

绿*闪烁*

实验进行中

3.按压机器正面上唯一的按钮，放入已经封膜完成之96或384孔盘。

放置完成后，左右两警示灯都呈现绿色。

∙启动软件

1.开启计算机，并以正确的使用者名称与密码登入Windows。

Username:

OPERATOR

Password:

LC480

2.开启LightCycler480软件，并输入正确的使用者与密码。

二．软件设定--开启新实验

∙设定新实验

1.软件开启后，会进入主画面。

点选“NewExperiment”。

2.出现实验设定窗口。

任何时候需要回主画面的话，点选画面右边的按钮。

∙设定实验

v若要套用设定好的实验步骤（Template），请跳至6.。

1.在实验设定画面上方，先选择适当的DetectionFormat。

选项包含:

另外可再点选“Customize”勾选所需的滤片组合。

2.输入反应体积:

96wellplate范围为10-100ul，而384wellplate范围为5-20ul。

3.设定实验步骤（Program）

∙设定program，包含有Pre-incubation,Amplification（PCR）,Meltingcurve（optional）与Cooling。

利用『+』与『－』增加或删除步骤。

∙设定循环数目（Cycle）与分析模式。

通常Amplification（PCR）program设定成『Quantification』，而MeltingCurveprogram设定成『MeltingCurve』。

4.设定详细温度变化（依照不同实验方法与设计而有所不同）

∙点选各个program即可设定详细温度变化步骤，请根据产品说明书来设定，利用『+』与『－』增加或删除步骤。

需要设定的参数包含Target（℃）目标温度，AcquisitionMode（荧光侦测模式），Hold（hh:

mm:

ss）停留时间。

RampRate（℃/s）为升降温速度，范围如下：

RampRate（℃/s）

Heatingup

Coolingdown

96-wellBlock

1.0–4.4℃/s

1.0–2.2℃/s

384-wellBlock

1.0–4.8℃/s

1.0–2.5℃/s

v若设定温度低于50℃，请把RampRate调整成1.5℃/s（96well）或2.0℃/s（384well）。

5.将实验步骤储存成『Template』以便下次进行套用。

点选左下角“SaveAsTemplate”即可把此步骤储存起来。

6.若要进行套用时，请直接点选窗口左下角“ApplyTemplate”，选择欲套用之实验步骤即可。

7.设定完成后点选“StartRun”开始进行实验。

8.跳出档案储存窗口，请输入欲储存之文件名称。

v实验进行中会进入另一个Data窗口，窗口下方按键功能如下：

✓EndProgram:

结束此Program,进入下一个Program。

✓+10Cycles:

实时增加循环数目。

✓AbortRun:

马上结束此实验，请注意，若按此键，则此次实验的结果将不储存。

三．样品编辑

∙将样品分群

1.点选窗口左边的“SubsetEditor”。

2.点选“New”新增新的群组，并将其命名。

3.利用鼠标选取此群组之样品位置，点选窗口右下角“Apply”，此时被选取的样品位置会呈现实心的蓝色，如下图。

4.以此方式依序将所有样品群组编辑完毕。

v样品必须分群才能够独立分析，但是样品是否分群并不影响样品的Cp值。

∙编辑样品名称

1.点选窗口左边的“SampleEditor”。

2.输入每个位置之样品名称（Name）与重复（Repl.Of）。

3.若要更快速输入，可直接在左边的图上点选欲编辑之样品：

v若A1,A2与A3为三重复，在A2与A3Repl.Of字段上都填上A1即为三重复。

v在编辑过程中，可利用『Ctrl』+『C』复制文字，『Ctrl』+『V』贴上文字。

4.根据实验分析模式，编辑AbsQuant（绝对定量），RelQuant（相对定量），或Genotyping分页，设定SampleType。

绝对定量（AbsQuant）：

『Unknown』:

未知浓度样品

『Standard』:

已知浓度标准品

相对定量（RelQuant）：

『Target』:

目标基因

『Reference』:

参考基因

『Calibrator』:

Control样品

『Standard』:

已知浓度的样品

『Unknown』:

未知浓度样品

v其它分析模式之分页在此不赘述，请自行参考LightCycler480InstrumentOperator’sManual。

5.若设定成『Standard』之样品请输入浓度。

6.若想要将此样品编辑储存成Template，可点选窗口左下角“SaveAsTemplate”即可，下次实验时可点选“ApplyTemplate”进行套用。

四．结果分析

∙点选左边的“Analysis”，选取分析模式，并选择所需分析之群组，如下图：

1.

分析模式

说明

AbsQuant/2ndDerivativeMax

绝对定量（自动法）

AbsQuant/FitPoints

绝对定量（手动法）

ColorCompensation

色差校正（多色实验校正用）

GeneScanning

基因扫描（适用于HighResolutionMeltingCurve,HRM分析）

Genotyping

基因分型（适用于HybProbe之基因分型实验）

RelativeQuantification

相对定量

TmCalling

Tm分析

∙绝对定量（AbsoluteQuantification）

1.点选下方的“Calculate”即可得到样品之Cp与标准曲线。

重複樣品平均後之Cp值與濃度,並自動計算標準差

2.数值之数据输出:

在数值分析表上按鼠标右键，点选“Export”即可输出成.txt档案格式。

可直接以MicrosoftExcel软件开启。

3.图形输出:

在图形上按鼠标右键，点选“Export”即可输出成各种图形档案格式。

4.标准曲线储存:

点选窗口下方StdCurve之“Saveasexternal”，输入适合档名后即可储存在数据库中。

∙相对定量（RelativeQuantification）

1.在选择相对定量分析后，出现下面窗口：

vReferenceSampleLocation:

若Reference（Housekeepinggene）之样品在同一盘上请选择“In-Run”，否则请选择“External”可输入另一次实验的数据一起分析。

v建议将AutoPair打勾让计算机自动将样品配对。

2.进入『Target』与『Reference』分页，右下角显示“Eff=2”表示将目标基因与参考基因的PCR效率以2.0来计算。

3.若需要校正目标基因与参考基因之PCR效率，则需要输入标准曲线。

在『Target』与『Reference』分页之右下角，输入（import）标准曲线。

vUseinrun：

输入（import）同一盘上之标准曲线。

vUseexternal：

输入（import）之前已储存于数据库中之标准曲线。

4.点选『Pairing』分页，检查计算机自动配对结果是否正确。

其中，红色表示Unknown样品，绿色表示Calibrator样品。

若欲外加配对，则可直接以鼠标点选样品后按“Add”即可增加配对。

5.点选『Results』分页，点选“Calculate”即可得到计算结果。

6.数值和图形输出与绝对定量相同。

（请参考绝对定量）

∙基因分型（Genotyping）

1.进入基因分型的窗口中。

2.窗口右下角可设定分类方式

vAutoGroup：

自动分组

vIn-run：

标准品包含在本次实验中

vExternal：

标准品在之前已储存之实验中

3.点选“Calculate”即可得到分型结果。

∙Tm分析（TmCalling）

1.进入Tm分析窗口

2.确认波峰数目

3.选择检测模式

4.点选“Calculate＂即可得到每个样品之Tm值。

五．报告（Report）

1.将分析后结果储存后即可点选报告键。

数据储存　　　　　报告

2.勾选想要呈现的报告内容。

3.点选“Generate”即可产生报告。

4.点选“PDF”即可将此报告储存成.pdf档案格式。

六．数据转移至其它计算机（数据输出与输入）

∙数据输出

1.点选（navigator）

2.点选所要输出的实验档案，点选即可将档案输出成.ixo档案

3.将此ixo档案以光盘或随身碟存到另一计算机

∙数据输入

1.分析计算机上开启LightCycler480软件，登入后点选

2.点选　，选取所要输入的.ixo档案并开启，即可开始进行实验数据分析

3.点选将此实验档案储存至数据库中

七．使用者管理

1.点选右方工具键。

2.点选“UserandGroups”。

3.点选“New”即可新增使用者，并设定使用者名称、密码与权限。