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培养基配方及配置
培养基配方及配置
根据其作用不同,培养基分为:
诱导培养基
增殖培养基
生根培养基
根据其营养水平不同,培养基可分为基本培养基和完全培养基。
基本培养基(就是通常称呼的培养基)主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。
完全培养基就是基本培养基的基础上,根据试验的不同需要,附加一些物质,如生长调节物质和其他复杂有机物质等。
N6培养基特点:
•1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计
•成分简单
•KNO3和(NH4)2SO4含量高
•广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养等
White培养基特点:
•1943年由White为培养番茄根尖而设计的。
1963年又作了改良,称作White改良培养基。
•特点:
无机盐含量较低
•适用:
生根培养。
B5培养基特点:
•含较低的铵
•双子叶植物尤其木本植物组培可选择
MS培养基特点:
无机盐、离子浓度高,硝酸盐含量较高。
MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。
无机盐的浓度较高,能保证组织培生长所需的矿物质营养。
并且因为离子浓度高,在配制、贮存、消毒过程中,即使有些成分略有出入,也不致影响培养基中的离子平衡
培养基配方明细表:
培养基成分:
一、无机盐:
氮枝叶生长需要氮素,缺氮老叶先发黄;氮过量,枝叶过度茂盛。
磷缺磷,植株生长缓慢,老叶暗紫色。
钾促进花卉生长健壮,增强抗性,茎秆挺拔。
缺钾,叶尖、叶缘枯焦,叶片呈皱曲状,老叶发黄或火烧状。
钴缺钴,叶片失绿而卷曲,整个叶片向上弯曲凋枯。
二、有机物
碳水化合物:
选用种类:
蔗糖(或葡萄糖、果糖)等
•蔗糖浓度:
2%~3%,胚培养为4%~15%
•大生产时可用白糖
糖在培养基的作用:
1)为细胞提供合成新物质的碳骨架
2)为细胞的呼吸代谢提供底物和能量
3)维持渗透压
维生素
种类:
VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB3(烟酸)、Vc(抗坏血酸
浓度:
0.1-1.0mg/L
作用:
VB1促愈伤组织产生,提高活力
VB6促根生长
Vc防组织褐变
VB3与植物代谢和胚的发育有关系
氨基酸:
甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。
因培养基的种类不同,其种类和浓度不同。
肌醇:
又称环己六醇,在糖类的转化中起作用
天然复合物
椰乳:
促愈伤组织和细胞培养,用量10-20%,使用注意茎尖大小
香蕉泥:
用量150-200ml/L,应用在兰花组培
马铃薯汁液:
用量150-200g/L,使苗壮
水解酪蛋白:
浓度100-200mg/L,应用在微茎尖培养
三、激素
自然界中,植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物,它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、生长、发育,影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多生理生化活动。
在培养基中,其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。
激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化,胚状体的形成等。
通常,不同植物,或不同品种,甚至同一植物的不同位置对激素的要求有很大的变化,这主要取决于植物的内源激素水平。
组织培养中使用的激素有的是天然的,如脱落酸(ABA)等,有的是合成的,如二氯苯氧乙酸(2,4-D)
(一)、激素的种类:
1、生长素类:
在自然界中,生长素影响茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象
在组织培养中的主要作用是:
诱导细胞的分裂和根的分化,诱导愈伤组织)
组织培养中常用的生长素:
1二氯苯氧乙酸(2,4-D)
2萘乙酸(NAA)
3吲哚乙酸(IAA)
4吲哚--3-丁酸(IBA)
NAA、IAA、IBA被广泛用于生根,2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长。
IAA容易光解,注意用棕色试剂瓶保存,保存时间不要太久。
溶解方法:
1MNaOH或95%酒精,以前者为好保存:
配成一定浓度后,冰箱冷藏保存
2、细胞分裂素
自然界中,细胞分裂素影响细胞分裂,顶端优势的变化和茎的分化等
组织培养中,细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。
细胞分裂素常常与生长素相互配合,用以调节细胞分裂,细胞伸长,细胞分化和器官形成。
常用的细胞分裂素有:
6-苄氨基嘌呤(6-BA)
激动素(6-糠氨基嘌呤、KT)
玉米素(ZT)
噻二唑苯基脲(thidiazuron、TDZ)
溶解方法:
1MHCL
保存:
配成一定浓度后,冰箱冷藏保存
3、赤霉素
由日本人黑泽1926年发现。
自然界中,赤霉素能够打破休眠、促进果实成长等效果。
虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究,但在培养基中很少添加,因为它的作用往往是负面的。
虽然也有赤霉素能刺激不定胚发育成正常小植株的报道,但在使用中仍需慎重,不可轻易添加。
赤霉素有20多种,其中在组织培养中最常用的是GA3。
在组织培养中与生长素和细胞分裂素相比,赤霉素不太常用,据报道赤霉素能刺激不定胚正常发育成小植株
溶解方法:
95%酒精
保存:
配成一定浓度后,冰箱冷藏保存
赤霉素易溶于水,但溶于水后不稳定,容易分解
灭菌:
高温易分解,要过滤灭菌
4、脱落酸
在自然界中,脱落酸能阻碍发育、促进老化、形成休眠芽等作用。
经试验表明,脱落酸有利于胚性愈伤组织形成正常不定芽。
材料的试管保存,加上脱落酸能抑制生长,使继代培养时间延长。
溶解:
易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。
保存:
具有热稳定性,但容易发生光解。
配成一定浓度后,冰箱冷藏保存
四、培养体支持材料
•1.琼脂
•用量7-10g/L(0.7%-1%)
注意:
1若浓度过高,培养基就会变得很硬,营养物质就难于扩散到培养的组织中。
2当进行营养需要研究时,应注意不要使用琼脂,因为市场供应所有琼脂含有杂质,特别是含有Ca,Mg和微量元素。
•3.其它
卡拉胶、玻璃纤维、滤纸桥、海绵等
五、辅助性物质
•1).抗生素:
1.常用种类:
青霉素 链霉素庆大霉素等
•2.用量:
5%-20%
•3.作用:
防止由外植体内生菌造成的污染。
•4过滤灭菌
•2.)抗氧化物:
常用抗氧化剂及使用:
•半胱氨酸VC(50-200mg/L液洗涤外植体伤口表面)。
•3)活性炭:
•1.作用:
具吸附作用;茎尖初代培养可防褐化;促进新梢增殖(浓度0.1-0.2%);促进生根;防止组培苗玻璃化(浓度0.3%)。
利于胚胎培养。
•2.常用浓度:
0.5-10g/L
•3.活性炭的作用
•①对生长的抑制:
其吸附了植物激素
•②对生长的刺激:
其吸附了有抑制作用的物质
•
培养基配制
(二)母液配制要求:
•1.母液浓缩倍数:
10-100,大量元素10;微量元素、铁盐100;有机物50;
•2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂
•3.防止沉淀
•4.激素母液浓度:
1mg/ml,1次配成50或100ml
•5.激素溶解:
IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容;
•NAA先溶于热水或95%酒精再加水;
•2,4-D先溶于1MNaOH再加水;
•KT、BA先溶于1MHCl再加水。
MS培养基母液的配制
培养基熬制:
1.将定容好的培养液取1/3倒入铝锅中,同时加入称好的蔗糖和琼脂,边煮边搅拌,防止糊底。
2.用旺火煮开,再用文火加热,直至琼脂全部融化。
3.将容量瓶中剩余的液体一并倒入铝锅中,摇晃使均匀。
调PH值:
•用0.1MNaOH或HCl调PH值为6.0。
分装:
趁热分装,100ml的三角瓶约装入30-40ml。
扎口与灭菌:
•要求封口松紧适宜,系活扣,便于接种操作。
•培养基应及时灭菌,防止变质。
灭菌后,应尽快地转移培养瓶使其冷却,一般应将灭菌后的培养基储藏于30℃以下的室内名,最好储藏在4-10℃的条件下。
应当注意的是,某些生长调节物质如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素是不稳定的,不能和其他的培养基一起高压灭菌,而要进行过滤灭菌。
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