高三生物一轮复习 22 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.docx
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高三生物一轮复习22土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【目标导航】 1.能利用选择培养基分离细菌。
2.能运用稀释涂布平板法测定土壤中分解尿素细菌的数量。
一、研究思路
1.课题背景
尿素是一种重要的农业氮肥,但农作物不能(能、不能)直接吸收利用,而是首先通过土壤中的细菌将尿素在脲酶的催化下分解为氨之后,才能被植物吸收。
2.筛选菌株
微生物筛选的原理:
人为提供有利于目的菌株生长的条件,同时抑制或阻止其他微生物生长,如可从热泉中将Taq细菌筛选出来。
3.统计菌落数目
(1)测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目
①为了保证结果准确,一般设置多于3个平板,选择菌落数在30~300的平板进行计数,并取平均数。
②统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,因此,统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
4.设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。
二、实验设计
1.操作步骤:
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察。
2.土壤取样一般要铲去表层土,因为绝大多数细菌分布于距地表约3~8__cm的土壤层。
3.样品的稀释:
不同的微生物需要稀释的倍数不同,请填写下表:
微生物
稀释倍数
细菌
104、105、106
放线菌
103、104、105
真菌
102、103、104
4.微生物的培养与观察
微生物的生长受温度的影响,菌落的数目和特征是观察的主要内容。
三、操作提示
1.无菌操作:
取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
称取土样要在火焰旁进行。
稀释样品要在火焰旁操作。
2.做好标记:
要对平板和试管进行标记,尤其进行系列稀释时要按稀释度递增顺序将试管排列成行。
四、课题延伸
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨,使培养基的碱性增强。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌,若指示剂变红,可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
判断正误:
(1)选择培养基只允许特定的微生物生长,而抑制或阻止其他微生物的生长( )
(2)对活菌进行计数时,所做的平板越大越好( )
(3)设置对照实验可以排除一些非测试因素对实验结果的影响( )
(4)从土壤中取样时,土层越浅越好( )
(5)来自土壤的微生物稀释倍数越大越好( )
答案
(1)√
(2)× (3)√ (4)× (5)×
一、选择培养基相关问题分析
1.概念:
在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基,称作选择培养基。
2.原理:
根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
例如:
用培养基选择能分解尿素的微生物的原理
培养基的氮源为尿素,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。
缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源,而不能生长、繁殖,所以用此培养基就能够选择出能分解尿素的微生物。
3.方法
(1)在培养基中加入某种化学物质。
例如,加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌;加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。
这里的“加入”是在培养成分的基础上加入。
(2)改变培养基中的营养成分。
例如,缺乏氮源时可以分离固氮微生物;石油作为唯一碳源时,可以分离出能消除石油污染的微生物。
(3)改变微生物的培养条件。
例如,将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物。
1.伊红美蓝培养基为什么不是选择培养基?
答案 伊红美蓝只能显示有无大肠杆菌,不能实现只允许一种微生物生存而抑制或影响其他微生物的生存,所以伊红美蓝培养基不是选择培养基。
2.一种自养微生物与多种异养微生物混合在一起,如何将自养微生物选择出来?
答案 用不含有机碳源的培养基进行培养,因为自养微生物可以利用空气中的CO2而异养微生物不可以,所以能在培养基中生存的就是自养微生物。
3.2013年11月22日凌晨3点,青岛黄岛区发生石油泄漏事件,一些微生物可以有效地分解石油,如何配制选择培养基将这类微生物选择出来?
答案 配制的选择培养基中,石油作为唯一的碳源,然后用这种培养基培养多种微生物,凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。
1.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质,自然界中存在着降解苯酚的微生物。
某工厂产生的废水中含有苯酚,为了降解废水中的苯酚,研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株,筛选的主要步骤如图所示,①为土壤样品。
请回答下列问题。
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为唯一碳源,②中不同浓度碳源的培养基__________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量,如果要测定②中活细菌数量,常采用______________法。
(2)④为对照,微生物在④中不生长,在⑤中生长,④与⑤培养基的主要区别在于______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________;
使用__________________________________法可以在⑥上获得单菌落。
采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是____________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染?
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
【问题导析】
(1)题目中的目的菌株是降解苯酚的细菌,选择培养基与完全培养基相比最大的差别是碳源不同,选择培养基中苯酚是唯一的碳源。
(2)苯酚的浓度会对能分解苯酚的细菌产生影响。
能否生存取决于细菌能否利用苯酚,细菌的分解能力可以通过改变苯酚的浓度判断出来。
答案
(1)苯酚 影响 稀释涂布平板
(2)④的培养基没有加入苯酚作为碳源,
⑤的培养基加入苯酚作为碳源 稀释涂布平板法或平板划线 以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基 (3)培养基灭菌,接种环境灭菌,接种过程无菌操作
解析 根据微生物对营养的需求,在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长,抑制或阻止其他杂菌生长的目的,然后再用稀释涂布平板法、平板划线法或其他方法筛选出单个目的菌落,再接种培养即可获得纯目的菌。
为防止培养基中水分蒸发形成的水珠落入培养基中影响菌体生长,所以要将培养皿倒置。
在设计实验中要注意单一变量原则和对照原则,操作中要严格进行无菌操作。
【一题多变】
(1)为什么测定活菌的数量不能用平板划线法?
答案 由于在所划的线中,只有最后一次划线的末端才会形成由一个细菌形成的菌落,而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成,而在计数时一个菌落对应着一个细菌,这样在划线所得的平板中,菌落数目低于活菌的实际数值,所以不能用平板划线法测定活菌数量。
(2)如何判断培养基是否被污染?
答案 在不接种微生物的情况下将培养基在培养箱中进行培养,如果培养基中无菌落出现,则说明没有被污染,如果有菌落出现,则说明培养基被污染。
(3)两位同学在取土壤样品时,一位同学在不含苯酚的土壤中取样,另一位同学在含苯酚的土壤中取样,哪位同学做法较好?
答案 在含有苯酚的土壤中取样较好。
二、统计菌落的数目
1.显微镜直接计数法(总菌计数法)
(1)原理:
此法利用特定细菌计数板或血球计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
(2)方法:
用计数板计数。
计数板是一块特制的载玻片,上面有一个特定的面积为1mm2和高为0.1mm的计数室,在1mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格,每个中格进一步划分成16个(或25个)小格,但计数室都是由400个小格组成的,如图所示。
(3)计算公式:
每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
(4)缺点:
不能区分细菌的死活。
2.间接计数法(活菌计数法)
(1)原理:
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)计算公式:
每克样品中的菌株数=(C÷V)×M。
其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。
(3)统计方法:
统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好能统计3个平板,计算出平板上菌落数的平均值,然后按公式进行计算。
2.自然界中的微生物往往是混杂生长的。
人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯,然后进行数量的测定。
下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验,请回答有关问题。
步骤如下:
①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
②为了得到更加准确的结果,应选用__________法接种样品。
③适宜温度下培养。
结果分析:
(1)测定大肠杆菌数时,在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下几种统计结果,与事实更加接近的是__________。
A.一个平板,统计的菌落数是230
B.两个平板,统计的菌落数是220和260,取平均值240
C.三个平板,统计的菌落数分别是400、212和256,取平均值289
D.四个平板,统计的菌落数分别是210、260、240和250,取平均值240
(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212,那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2mL)__________。
(3)用这种方法测定菌体密度时,实际活菌数量要比测得的数量__________(多/少),因为_____________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
【问题导析】
(1)因为题中操作的目的需要对大肠杆菌进行数量的测定,所以接种的方法是稀释涂布平板法。
(2)测定活菌数量时,选择的平板越多误差越小,且选择的平板要能形成30~300个菌落。
(3)所做的多个平板中,如果其中一个平板中菌落的数目
明显多于或少于其他几个平板,则说明该平板不符合要求,应重做或舍弃。
答案 步骤②:
稀释涂布平板
(1)D
(2)1.06×109个
(3)多 当两个或多个细菌连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
解析 若对大肠杆菌进行计数,则需要用稀释涂布平板法接种样品。
(1)应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数,取其平均值。
(2)212÷0.2×106=1.06×109(个)。
(3)因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成,所以实际活菌数量要比测得的数量多。
【一题多变】
(1)如果某同学的稀释倍数仅为104,则测定的数值要比题中操作的数值高还是低?
为什么?
答案 低,因为稀释倍数太低,则大部分菌落是多个细菌繁殖而成,所以观察到的菌落的数值要低于由单一细菌形成的菌落数值。
(2)第
(1)小题C项中菌落数为400的平板不符合要求,试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。
答案 ①培养基被污染,一些菌落是由杂菌繁殖而成的;②接种过程中由于操作不当感染了杂菌;③取菌液时没有摇晃,所取菌液中细菌个体浓度偏大等。
1.可以分离并鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂
D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
答案 A
解析 尿素在尿素分解菌的作用下分解产生氨和CO2,氨会使培养基的碱性增强,pH升高,酚红指示剂变红。
2.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。
利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
为选择酵母菌和硝化细菌,应选用的培养基分别为( )
A.伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基
B.含青霉素的培养基、含氨的无机培养基
C.含氨的无机培养基、含青霉素的培养基
D.含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基
答案 B
解析 酵母菌是真菌,通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养,因为青霉素能够抑制细菌生长,但不能够抑制真菌生长。
硝化细菌为自养型生物,能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量把无机物转变为有机物以维持自身生命活动,利用含氨的无机培养基可进行选择培养。
3.下列有关微生物培养的叙述错误的是( )
A.在对微生物进行培养前,需要对微生物和培养基进行灭菌
B.分离能分解尿素的细菌,要以尿素为培养基中唯一的氮源
C.测定土壤样品中的细菌数目,常用稀释涂布平板法进行菌落计数
D.酵母菌发酵过程产生的酒精,对其他微生物生长有一定的抑制作用
答案 A
解析 在对微生物进行培养前,只需要对培养基和器皿进行灭菌;分离能分解尿素的细菌,要以尿素为培养基中唯一的氮源,以去除不能分解尿素的微生物;当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,故稀释涂布平板法可用于菌落计数;酒精对细胞有毒害作用,酵母菌发酵过程中产生的酒精对其他微生物的生长有一定的抑制作用。
4.某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌,并统计每克土壤样品中的活菌数目,培养基配方如下表:
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
蛋白胨
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4g
2.1g
0.2g
1.0g
10.0g
1.0g
15.0g
(1)根据培养基的成分判断,该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌?
______(能/不能),原因是____________________________________________。
(2)该培养基为______培养基(按物理状态分),因为培养基中含有______________。
(3)要统计每克土壤样品中活菌数目,宜采用____________________法。
根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积,统计平板上的________就能大约推测出样品中的活菌数。
(4)如果把该培养基中的蛋白胨去掉,培养基上的微生物是不是一定都是能分解尿素的细菌?
________。
为什么?
__________________________________。
答案
(1)不能 培养基含蛋白胨,尿素不是唯一氮源,不能选择出只以尿素为氮源的微生物
(2)固体 凝固剂琼脂
(3)稀释涂布平板 菌落数目
(4)不一定 因为有些微生物可以利用尿素分解菌的含氮代谢产物进行生长繁殖
解析 选择分解尿素的细菌必须在以尿素为唯一氮源的选择培养基上进行;配方中以琼脂作为凝固剂,因此该培养基为固体培养基;常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目;如果把该培养基中的蛋白胨去掉,由于培养基中尿素是唯一氮源,因此可以作为分解尿素的微生物的选择培养基;但是有些微生物可以利用尿素分解菌的含氮代谢产物进行生长繁殖,因此该培养基上培养的微生物并不一定都能分解尿素。
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