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id1在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达及意义
【摘要】 目的通过检测宫颈癌及其癌前病变组织中dna结合抑制因子-1(id-1)蛋白和mrna的表达情况,探讨id-1在宫颈癌变过程中的作用。
方法采用免疫组化sp法检测id-1蛋白在15例慢性宫颈炎、17例cin?
、25例cin?
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和79例宫颈癌组织中的表达;采用实时荧光定量rt-pcr法检测id-1mrna在10例慢性宫颈炎、8例cin?
、9例cin?
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和8例宫颈癌组织中的表达。
结果慢性宫颈炎、cin?
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、宫颈癌组织中id-1蛋白表达阳性率呈逐渐升高趋势(p<0.01),分别为0、11.8%、40.0%、74.7%;cin?
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和宫颈癌组织中id-1mrna的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍,随宫颈癌变程度加重id-1基因表达增加(p<0.05)。
结论随着宫颈癌变程度加重,id-1表达逐渐增加,表明id-1可能参与了宫颈癌的发病机制。
【关键词】 宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;id-1;dna结合抑制因子-1;实时荧光定量rt-pcr abstractobjectivetoinvestigatetheeffectoftheinhibitorofdnabinding-1(id-1)intheprocessofcarcinogenesisofcervicalcancerbydetectingtheexpressionofid-1proteinandmrnainthecervicalcanceranditsprecancerouslesions.methodstheexpressionsofid-1proteinin15chroniccervicitis,17cin?
25cin?
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and79cervicalsquamouscancerswereassessedbyimmunohistochemicalspmethods.real-timefluorescencequantitativert-pcr(qrt-pcr)wasusedtodetecttheexpressionlevelofid-1mrnain10chroniccervicitis,8cin?
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and8cervicalsquamouscancersrespectively.resultsitwasfoundthattheexpressionlevelofid-1proteinfollowedthispattern:
cervicalcancer>cin?
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>chroniccervicitis(p<0.01),andthepositiveexpressionrateofid-1proteinwas74.7%,40.0%,11.8%and0.0%respectively.therelativeamountofid-1mrnaexpressionincin?
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andcervicalcancerisrespectively1.34times,3.42timesand10.37timesofthatinthechroniccervicitis,whichindicatesthattheid-1mrnaexpressionincreaseswiththeproceedingofcervicalaffection.conclusiontheid-1expressionwasincreasedwiththeaggravationofcervicallesions.itsuggeststhatid-1mighthaveparticipatedinthepathogenesisofcervicalsquamouscellcarcinoma. keywordscervicalcancer;cin;id-1;inhibitorofdnabinding-1;real-timefluorescencequantitativert-pcr 近年研究发现,dna结合抑制因子-1(id-1)作为一种转录调节因子在多种上皮来源的恶性肿瘤中表达升高,并且与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及血管生成等有关1。
目前对id因子与宫颈癌的相关研究国内外仅见一篇报道,即schindl等2的研究,但对id-1在宫颈癌变过程(慢性宫颈炎?
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→宫颈癌)中的研究尚未见报道。
为此笔者采用免疫组化sp法和实时荧光定量rt-pcr法,首次定性与定量研究id-1蛋白和mrna在慢性宫颈炎、cin?
、cin?
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和宫颈癌组织中的表达,初步探讨id-1在宫颈癌发生发展中的作用及意义,为宫颈癌的病因学研究和基因靶向治疗提供一个新线索。
1材料与方法 1.1研究对象 1.1.1免疫组化 选取我院病理科保存的2004-2009年宫颈癌变相关组织石蜡标本136例,患者年龄23~68岁,平均(42.56±8.20)岁。
依据病理表现分四组,即慢性宫颈炎组15例、cin?
组17例、cin?
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组25例、宫颈癌组79例。
所有标本均由≥2名的病理学专家再次阅片确诊。
选定的石蜡标本均经中性甲醛固定,石蜡包埋,4μm连续切片。
1.1.2实时荧光定量rt-pcr 经伦理委员会批准并取得患者知情同意后,选取2008年10月-2009年10月在我院行宫颈活检或子宫切除术的患者作为本研究对象。
所有患者术前均未接受放、化疗或手术治疗。
所取新鲜组织标本大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm,液氮保存备用。
最后根据病理结果纳入慢性宫颈炎组10例、cin?
组8例、cin?
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组9例、宫颈癌组8例,共35例,年龄26~57岁,中位年龄37岁。
阳性对照为卵巢癌1例,年龄55岁。
1.2实验方法 1.2.1免疫组化sp法检测id-1蛋白的表达
(1)一抗id-1兔抗人多克隆抗体购自美国santacruz公司,免疫组化sp超敏试剂盒为天津津脉基因测绘技术有限公司产品。
具体实验步骤按照说明书进行。
以磷酸盐缓冲液(pbs)代替一抗作阴性对照,阳性对照由santacruz公司提供。
(2)采用olympus光学显微镜观察各试验组宫颈组织中id-1表达情况,由2名试验人员双盲法独立分别对试验结果进行半定量评分,最终结果取均值或协商确定。
id-1免疫组化阳性着色主要定位于胞浆,为棕黄色或棕褐色。
根据着色深浅和阳性细胞比例对免疫组化结果进行半定量评分,确定表达强度分级。
具体评分标准见参考文献2。
1.2.2实时荧光定量rt-pcr检测id-1mrna的表达
(1)trizol提取组织总rna,-70℃保存备用。
(2)id-1和β-actin基因引物和taqman探针由takara公司合成,见表1。
(3)id-1基因为单外显子,逆转录前用dna酶处理。
按照revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit试剂盒(立陶宛mbi公司)说明书进行操作,逆转录获得cdna。
逆转录条件为20℃10min→42℃60min→70℃10min,-20℃保存备用。
(4)标准曲线的制备:
用假定初始拷贝数(x)的cdna模板按10倍梯度进行稀释,自每个稀释模板中取样2μl,分别加入30μl的反应体系中行实时荧光定量rt-pcr。
扩增条件为94℃预变性2min;94℃20s,54℃(id-1)/52℃(β-actin)20s,60℃30s,45个循环;最后60℃延伸5min。
将pcr仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期,在该时相读取ct值。
(5)待测样本目的基因相对拷贝数的测定:
将逆转录得到的cdna样品各取2μl,加入和上面完全相同的反应体系,在同样的反应条件下行pcr扩增,测定各样品的ct值,采用比较阈值法计算目的基因拷贝数=2-δδct,δδct=(ctid-1-ctβ-actin)试验组-(ctid-1-ctβ-actin)参照组。
本研究目的基因为id-1,管家基因为β-actin,参照组为慢性宫颈炎组。
2-δδct表示的是试验组目的基因的表达相对于参照组的变化倍数。
表1id-1和β-actin基因引物及探针序列 1.3统计学分析应用spss13.0软件系统对所得数据进行统计学处理,检验水准取双侧α=0.05。
统计方法包括χ2检验、单向方差分析(one-wayanova)。
2结果 2.1id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达慢性宫颈炎组织中未见id-1蛋白阳性表达,而宫颈癌及癌前病变组织中均有不同程度的id-1免疫阳性反应,主要定位于细胞质,表现为棕黄色或黄色颗粒样物质。
id-1表达阳性率随宫颈癌病变程度的加重而升高,在慢性宫颈炎、cin?
、cin?
~?
和宫颈癌组织中id-1阳性表达率分别为0、11.8%、40.0%和74.7%,差异有统计学意义(χ2=45.017,p=0.000)。
见表2、图1。
表2id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达水平 2.2id-1mrna在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达见表3。
对36例组织标本进行实时荧光定量rt-pcr检测,得标准曲线回归系数均>0.96,标准曲线拟合满意。
id-1基因扩增效率为1.97,β-actin为1.99。
可见,目的基因与管家基因的扩增效率基本相同,故可采用比较阈值法计算id-1基因拷贝数。
cin?
、cin?
~?
和宫颈癌组织中id-1mrna的相对表达量分别为慢性宫颈炎组的1.34倍、3.42倍和10.37倍,差异有统计学意义(p=0.003),id-1基因表达在宫颈癌组高于癌前病变组(p<0.05),而在慢性宫颈炎组织中的表达低于宫颈癌(p=0.031)和cin?
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组织(p=0.045)。
可见,随宫颈癌变程度加重id-1基因表达增加。
图1宫颈癌及其癌前病变组织中id-1蛋白的表达情况表3id-1mrna在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 3讨论 3.1id-1的结构与功能id-1是分化和(或)dna结合抑制因子(inhibitorofdifferentiationand/ordnabinding,id)家族成员之一,id因子是1990年由benezra等3首先从小鼠红白血病(murineerythro-leukemia,mel)细胞cdna文库中克隆出来的。
id因子属于hlh转录因子,也是迄今为止发现的惟一具有负性调控hlh基因家族功能的调控蛋白。
hlh蛋白是一类具有螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,hlh)结构域的dna结合蛋白,id因子可通过hlh结构中的α-螺旋相互作用与其他hlh家族转录因子(主要为bhlh类转录因子)结合形成二聚体,但因其结构内缺乏碱性残基区使得这种二聚体无法有效地结合到dna上,不能发挥转录因子活性,从而抑制相关基因转录,产生生物学效应。
在哺乳动物细胞中已发现4种id因子,即id-1~id-4。
目前对id-1的研究最多,发现其参与细胞分化调控、抑制肿瘤细胞凋亡、诱导细胞永生化、促进肿瘤血管生成等1,4,5,在癌症发生发展中起重要作用。
而且id-1在许多上皮来源的肿瘤,如食道鳞状上皮癌6、子宫内膜癌7,8、肺癌9、胃癌等均有高表达,推测id-1可能参与了这类上皮源性肿瘤的发生。
3.2id-1在宫颈癌变过程中的作用目前,关于id-1在宫颈癌变过程中表达情况的研究国内外尚无相关报道。
仅schindl等2利用免疫组化方法研究发现早期宫颈癌中有id-1高表达,表达阳性率为79.2%。
分别采用免疫组化sp法和实时荧光定量rt-pcr从蛋白和基因水平检测了慢性宫颈炎、cin?
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、宫颈癌组织中id-1的表达情况。
免疫组化结果显示,id-1表达阳性率与宫颈癌病变程度密切相关,在慢性宫颈炎、cin?
、cin?
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、宫颈鳞癌组织中id-1蛋白表达阳性率呈逐渐升高趋势(p<0.01),分别为0、11.8%、40.0%、74.7%,而且id-1的染色强度也随病变加重而加深,所有的宫颈癌及其癌前病变组织中均出现不同程度的id-1免疫阳性反应;实时荧光定量rt-pcr检测结果也从基因水平进一步证实了免疫组化的结论,即id-1mrna的表达也随宫颈癌变程度加重而增加,cin?
、cin?
~?
和宫颈鳞癌组织中id-1mrna的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍,差异有统计学意义(p<0.05)。
综上结果提示id-1过表达参与了宫颈癌的癌变过程,在宫颈癌的发病机制中可能起到了重要作用,但具体致癌机制有待进一步研究阐明。
流行病学和分子病毒学已有相当多资料证明,人乳头状瘤病毒(hpv)极有可能是宫颈癌的一个主要病因10。
在持续hpv感染的基础上,由慢性宫颈炎?
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cin?
~?
→宫颈浸润癌可能是大多数宫颈鳞癌的发病过程。
但hpv感染并不能完全解释宫颈癌的发生,比如,前瞻性研究发现宫颈感染hpv16/18型者在1年内只有1/3发展为cin,以后也仅约15%将发展为宫颈癌,其余大部分均自行消退。
可见宫颈癌的发生机制中,还存在其他hpv协同因素起重要作用。
本研究结果初步显示了转录调节因子id-1与宫颈鳞状上皮癌变进展有关,推测在hpv持续感染的基础上,id-1可能与hpve6/e7癌基因协同作用参与了宫颈鳞癌的发病机制,促进了宫颈癌变的持续恶性进展,但尚需更深入的研究证实。
细胞分化受阻引起无限增殖,导致细胞永生化是体外培养细胞恶性转化过程的第一步,也是体内肿瘤发生与发展进程的早期阶段。
大量试验结果表明,id-1具有“永生化”癌基因的某些特性11,如抑制细胞分化、引起细胞持续增殖及血管持续新生等。
id-1被认为是致癌性转化的一个重要调节因子。
tang等12研究发现,kshv(卡波济肉瘤相关病毒)感染人内皮细胞可诱导id-1表达增加,且内皮细胞增殖加快,提示id-l表达上调可能是细胞恶性转化的重要步骤。
外源性表达id-1可通过抑制p16ink4a/rb和p53途径使细胞永生化,促进细胞不断增殖,最终形成肿瘤4。
有研究显示,同时转染id-1和抗凋亡因子bcl-2可诱导成纤维细胞永生化13,仅id-1持续表达就可使皮肤上皮细胞的端粒酶活化,进而导致细胞永生化4。
此外,id-1可以通过激活nf-κb途径抑制肿瘤细胞凋亡,通过激活mapk途径诱导癌细胞增生,促进肿瘤发生。
ling等15的研究发现,通过基因转染上调前列腺癌lncap细胞id-1的表达,可增强nf-κb的反式激活及核转移,同时伴有下游效应因子bcl-xl和icam-1的表达上调,使肿瘤细胞凋亡受到抑制;而用反义寡核苷酸技术抑制id-1表达可抑制nf-κb的激活,使细胞对tnf-α诱导的凋亡敏感。
在前列腺癌细胞lncap中id-1的瞬间表达和稳定表达增加均可活化raf/mek1/2信号途径使癌细胞增殖明显加速,而当用mek1/2抑制剂pd098059阻断raf/mek1/2信号途径后,细胞周期s期的有丝分裂受抑制,细胞生长速度减慢,提示mapk信号途径的活化在id-1诱导的前列腺癌细胞增殖中起重要作用16。
总之,本研究结果表明id-1在宫颈癌发生发展中起重要作用,靶向抑制id-1基因表达可能给宫颈癌的治疗带来新的希望。
深入研究id-1在宫颈癌发病机制中的作用对宫颈癌的防治研究有重要意义。
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