类胡萝卜素与槲皮素对白血病K562细胞增殖及PPAR蛋白表达影响的研究.docx
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类胡萝卜素与槲皮素对白血病K562细胞增殖及PPAR蛋白表达影响的研究
授予单位代码
学号或申请号
密级
大学
硕士学位论文
论文题目:
类胡萝卜素与槲皮素对白血病
K562细胞增殖及PPAR蛋白表达影响的研究
作者姓名:
学科门类:
工学
专业:
应用化学
研究方向:
天然产物化学与生物化学
导师姓名、职称:
教授
2009年05月日
DissertationforMasterDegreeofAppliedChemistry
University
EffectofcarotenoidsandquercetinonK562cellproliferationandPPARγproteinexpression
Candidate:
Major:
Appliedchemstry
Supervisor:
Professor
SchoolofChemicalEngineering
University
P.R.China
May,2009
原创性声明
本人郑重声明:
所呈交的学位论文,是本人在导师赵文恩教授的指导下,独立进行研究所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。
对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。
本声明的法律责任由本人承担。
学位论文作者(签名):
年月日
学位论文使用授权声明
本人在导师赵文恩教授指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。
根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。
本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑州大学。
保密论文在解密后应遵守此规定。
学位论文作者(签名):
年月日
摘要
越来越多的研究表明,类胡萝卜素是重要的生物抗氧化剂。
进一步的细胞培养和动物实验结果显示,-胡萝卜素,以及其它饮食中存在的类胡萝卜素在预防和抑制癌症发生上有重要的作用。
槲皮素(3,3',4',5,7-五羟基黄酮)属类黄酮化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血压、抗心律失常、抗血小板聚集等广泛的药理作用,且毒副作用低。
PPAR是一种核激素受体,在脂肪细胞分化方面起着关键作用,研究表明,PPARγ也在许多人癌细胞中表达。
在脂肪肉瘤和乳腺癌细胞中该受体激活可抑制细胞生长并诱导细胞分化。
本研究以白血病细胞系K562细胞为靶细胞,研究类胡萝卜素与槲皮素抑制K562细胞的增殖,上调PPARγ蛋白表达的作用,探讨类胡萝卜素及槲皮素抑制肿瘤细胞生长的作用机制。
分别用不同浓度(0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L)的类胡萝卜素(-胡萝卜素、胭脂树橙和辣椒红素)与槲皮素处理K562细胞,通过台盼蓝拒染法检测其对K562细胞生长的影响,采用MTT法检测其对K562细胞活力的抑制率,用Western-blotting从蛋白分子水平上检测类胡萝卜素与槲皮素对PPARγ蛋白表达的影响。
研究结果显示:
类胡萝卜素与槲皮素处理组细胞的生长速度明显低于对照组,随着作用时间的延长,胭脂树橙、辣椒红素及槲皮素用药组活细胞数量逐渐减少,并呈现一定的时效关系。
在显微镜下可观察到下述细胞形态学改变:
经类胡萝卜素与槲皮素干预的细胞,特别是处理时间越长、处理剂浓度越高时细胞数明显减少,细胞大小不一、形态不规则,并可见许多细胞碎片;MTT结果显示:
类胡萝卜素与槲皮素显著抑制细胞的增殖并呈浓度依赖关系。
蛋白质免疫检测结果显示:
一定浓度的-胡萝卜素、胭脂树橙、辣椒红素及槲皮素能够上调PPARγ蛋白的表达,可诱导K562细胞的凋亡。
结论:
PPARγ表达的上调可能是类胡萝卜素和槲皮素抑制K562细胞增殖诱导其凋亡的原因之一,其中,类胡萝卜素与槲皮素是起着PPARγ非特异配体的作用。
关键词:
K562细胞;类胡萝卜素;槲皮素;PPARγ
Abstract
Agrowingbodyofevidencesuggeststhatcarotenoidshavesignificanteffectsonantioxidantpotential.Andthefurtherevidencefromcellcultureandanimalexperimentssuggeststhatβ-carotene,acarotenoidwiththegreatestpro-vitaminAactivity,couldbeacompoundresponsibleforthepreventionandtreatmentofcancer.
Quercetin(3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone)isanaturallyoccurringflavonoidfoundinallaerialplants.Inrecentyears,itwasfoundtopossavarietyofbiologicalactivities,suchasantitumor,antioxidation,antiviral,loweringbloodpressure,anti-arrhythmia,anti-plateletaggregation,andetc.Meanwhile,fewsideeffectshavebeenreported.
Peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ(PPARγ)isanuclearhormonereceptorthatplaysakeyroleinthedifferentiationofadipocytes.Previousstudiessuggestedthatactivationofthisreceptorinliposarcomasandbreastcancercellsalsoinducedcellgrowthinhibitionanddifferentiation.
Inthisstudy,leukemiacelllineK562cellswereusedastargetcells.TheinhibitionofcarotenoidsandquercetinonproliferationofK562cellsandtheeffectontheexpressionofPPARγproteinwereinvestigated.Alsothemechanismunderlyingthisrelationshipbetweencarotenoidsandquercetinandcancercellproliferationwasdiscussed.
K562cellsweretreatedwithdifferentconcentrationsofβ-carotene,bixin,capsanthinandquercetin(0.5μmol/L,1.0μmol/L,5.0μmol/L,10.0μmol/L,and20.0μmol/L).ThegrowthcurveofK562cellswasdetectedbystainingwithtrypanblueforviablecellscountswithahaemacytometer.TheinhibitionofK562cellproliferationwasevaluatedbytheMTTtest.TheexpressionofPPARγinK562cellswasexaminedbywestern-blottingatproteinlevel.
TheresultsshowedthattheK562cellgrowthrateincarotenoidsandquercetintreatmentgroupswereslowerthancontrolgroup.Withtheincreaseoftreatmenttime,thelivingcellnumbersinbixin,capsanthin,andquercetintreatmentgroupsweregraduallyreduced.TheproliferationofK562wasobviouslyinhibitedinadose-dependentmanner.Futhermore,thechangesincellmorphology,asindicatedbyreducedlivingcells,differentcellsize,irregularshapes,andalotofnuclearfragmentation,wereapparentaftercarotenoidandquercetintreatment.TheresultsofMTTtestalsoshowedthatcarotenoidsandquercetinremarkablydecreasedtheviabilityofK562cellsindose-andtime-dependentmanners.TheresultsofWestern-blottingshowedthatβ-carotene,capsanthin,bixin,andquercetincouldup-regulatetheexpressionofPPARγandmayinducetheapoptosisofthecellsaccordingly.
Accordingtotheseresults,itwerereasonabletoinferthattheup-regulationofPPARγexpressionmaycontributetotheantiproliferativeeffectsofβ-carotene,capsanthin,bixin,andquercetinonK562cells,amongwhichcarotenoidsandquercetinmayplayaroleasnonspecificligands.
KeyWords:
K562;carotenoids;quercetin;PPARγ
目录
摘要I
AbstractII
目录i
第一章前言1
1.1类胡萝卜素的生物学功能1
1.1.1医学生物学功能1
1.1.2细胞生物学功能3
1.2类胡萝卜素的分布4
1.3-胡萝卜素、辣椒红素及胭脂树橙的性质及生理活性4
1.3.1-胡萝卜素的性质及生理活性4
1.3.2胭脂树橙的性质及生理活性5
1.3.3辣椒红素的性质及生理活性6
1.4槲皮素的性质及功能7
1.4.1槲皮素分布及性质8
1.4.2槲皮素的功能8
1.5白血病的国内外研究现状10
1.6PPAR与肿瘤11
1.7研究的目的、内容和意义13
第二章实验15
2.1材料15
2.2试剂配制方法15
2.3仪器与设备16
2.4实验方法16
2.4.1样品制备16
2.4.2细胞培养及加药处理17
2.4.3台盼蓝拒染法检测细胞增殖17
2.4.4MTT(噻唑蓝)法检测细胞抑制率18
2.4.5Western-blotting检测细胞中的PPARγ蛋白表达18
2.4.6几种类胡萝卜素及槲皮素抗氧化能力测定18
2.5统计学分析19
第三章结果与分析20
3.1类胡萝卜素和槲皮素对K562细胞生长的影响20
3.1.1类胡萝卜素对K562细胞生长的影响20
3.1.2槲皮素对K562细胞生长的影响22
3.2类胡萝卜素和槲皮素对K562细胞活力的影响23
3.2.1类胡萝卜素对K562细胞活力的影响24
3.2.2槲皮素对K562细胞活力的影响26
3.3类胡萝卜素和槲皮素对PPARγ蛋白表达的影响27
3.3.1类胡萝卜素对PPARγ蛋白表达的影响27
3.3.2槲皮素对PPARγ蛋白表达的影响29
3.4FRAP法测定抗氧化能力(TAC)结果29
3.4.1类胡萝卜素与槲皮素的抗氧化能力30
3.4.2类胡萝卜素及与槲皮素结合的抗氧化能力31
3.5讨论31
3.5.1类胡萝卜素对K562细胞增殖及PPARγ蛋白表达的影响31
3.5.2槲皮素对K562细胞增殖及PPARγ蛋白表达的影响32
第四章结论35
参考文献36
致谢41
第一章前言
类胡萝卜素是自然界中最丰富的色素之一,颜色由黄色到红色。
类胡萝卜素都具有共同的化学结构特征,通常是由8个异戊二烯单位构成(C40),排列方式为分子中间的两甲基处于16位,其它侧链甲基为15位,以多个共轭的碳碳双键为生色系骨架的脂肪族或脂环族类型化合物。
类胡萝卜素分子中最重要的部分是决定生物学功能和颜色的共轭双键系统[1]。
现在已发现或通过基因工程的方法合成C30到C50的类胡萝卜素。
类胡萝卜素可分为碳氢元素构成的胡萝卜素类与含氧元素的叶黄素类两大类,为脂溶性色素,极个别含羰基或烯醇基的可溶于水。
类胡萝卜素吸收400~600nm的可见光,特殊的如八氢番茄红素与六氢番茄红素只吸收紫外光。
槲皮素属类黄酮化合物,广泛存在于水果、蔬菜中。
其化学结构酚羟基是抗氧化作用的基础,可供氢从而猝灭氧自由基,自身被氧化形成高稳定性的邻苯二酚结构,具有扩张冠状血管、抗血小板聚集、抗炎、抗过敏、抑制肿瘤细胞增殖等多种生物活性及药理作用[2]。
1.1类胡萝卜素的生物学功能
类胡萝卜素具有重要的生物学功能:
它们是重要营养物质维生素A的前体;是光合生物必不可少的组分;是一种很强的抗氧化剂,能高效淬灭单线态氧[3];它们在细胞膜上起着重要的作用,并能与其它蛋白质分子相互作用;它们与人类的健康有着密切的关系,能防御人类的一些疾病,对免疫反应系统有保护作用。
1.1.1医学生物学功能
a作为维生素A前体:
早在半个世纪前,人类就已知α-、β-胡萝卜素可水解生成维生素A,进而参与视觉生理过程,是防止由于维生素A缺乏而引起夜盲症的重要营养物质。
约有10%的类胡萝卜素是维生素A的前体,维生素A作为人体中一种关键的营养素,其缺乏会导致人的皮肤变厚、干燥、发生皱纹,会增加患癌症、心脏病、眼疾等多种疾病的危险[4]。
在多种类胡萝卜成分之中,-胡萝卜素经双氧合酶催化从分子中间水解可转化为两个维生素A分子。
b作为生物抗氧化剂:
类胡萝卜素可淬灭单线态氧,其淬灭单线态氧的能力如表1-1。
类胡萝卜素可清除活性氧自由基,包括过氧自由基、OH·、超氧阴离子自由基等,其对自由基的清除能力远远强于维生素E,此外对脂质过氧化、LDL氧化、膜不饱和脂肪酸氧化等均有很好的抗氧化效果。
大量的研究表明,类胡萝卜素抗氧化活性在其防病保护功能中起作用。
表1-l不同类胡萝卜素淬灭单线态氧的能力
类胡萝卜素
辣椒红素
胭脂树橙
-胡萝卜素
叶黄素
淬灭单线态氧的能力(109mol•L-1•S-1)
17.0
16.5
12.7
7.1
c增强机体免疫力的功能:
生物体内的免疫系统有两个主要功能:
一是能保护机体免受细菌、病毒等侵染性病原物引起的疾病,二是能抑制和预防癌细胞的生长。
Bendich[5]在其综述里指出:
(1)类胡萝卜素能增加免疫系统中B细胞的活力,使机体能消灭外源入侵的病原体;
(2)类胡萝卜素能提高CD4细胞(又称助手T细胞)的活力,能协助B细胞产生抗体,并提高其它免疫组分的活性;(3)类胡萝卜素能增加嗜中性白血球的数目,它可以包围细菌,并分泌降解细菌的酶;(4)类胡萝卜素能增加自然杀伤细胞(NK)的数目,以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。
d抗癌作用及其作用机制[6]:
流行病学研究一致清楚地表明,增加富含类胡萝卜素水果蔬菜摄食与癌发危险降低相关联。
1981年提出类胡萝卜素的抗癌作用,此后进行的许多活体外与活体研究都报道,-胡萝卜素与其它类胡萝卜素抑制癌细胞生长。
尤其是已报道类胡萝卜素减少或延缓动物模型上化学剂或紫外线诱发的致癌作用。
在包括结肠、黑素瘤、前列腺、口腔、肺和乳腺癌等肿瘤细胞上发现它们作为有力的生长抑制剂。
但是,由-胡萝卜素与视黄醇效力试验(CARET)和-生育酚、-胡萝卜素癌预防研究(ATBC)的人干预研究结果表明,补充-胡萝卜素的人接触香烟烟雾肺癌发生增加[7]。
最近的随机化结肠腺瘤复发研究中发现,-胡萝卜素使抽烟者或每天饮酒多次者腺瘤复发危险加倍。
而在河南林县进行的人群试验结果说明,-胡萝卜素可防止癌症。
深入研究使人们看到,用合成的纯-胡萝卜素进行补充试验无法与饮食摄取的类胡萝卜素相比,重度吸烟与饮酒者是特殊的人群。
近年在番茄红素进行的试验还未发现负结果。
目前,人们的兴趣集中在研究类胡萝卜素抗癌作用机制上。
类胡萝卜素的抗癌作用涉及引起细胞生长或细胞死亡过程上的一些变化,包括激素与生长因子的信号传输、细胞周期过程的调节、细胞分化及凋亡。
e减少心血管病发生:
研究表明[8],血清中的叶黄素水平增加20%可以明显减缓颈动脉内膜、中膜的增厚。
多项临床试验也显示,脂肪组织中的番茄红素具有预防心肌梗死的作用,血浆中的番茄红素浓度越高,其心血管病的危险性就越低。
补充一定量的富含番茄红素的食物,可以降低低密度脂蛋白中胆固醇[9]。
这可能是由于番茄红素抑制胆固醇生物合成酶反应所致。
f降低眼疾:
类胡萝卜素可以预防和改善与衰老关联的老年性眼病如黄斑退化和白内障[10]。
视网膜黄斑内玉米黄质与叶黄素是晶体内的唯一的类胡萝卜素。
研究证明,叶黄素和玉米黄质具有抗氧化性,可以吸收蓝光,从而保护视网膜免受损害。
1.1.2细胞生物学功能
a类胡萝卜素分子在细胞膜上的重要作用:
类胡萝卜素通常位于细胞膜上,是复杂的膜结构的一个组成成分。
研究表明类胡萝卜素分子在细胞膜上的定位特性取决于它们各自的具体结构特征。
所以,由碳氢元素组成的类胡萝卜素,如-胡萝卜素、番茄红素等,能完全进人膜的内部,并保持一定的运动性;而当类胡萝卜素分子中出现极性取代基,尤其当取代基是羟基时,它们在膜上的定位会受到很大影响。
不同结构的类胡萝卜素分子能与细胞膜上不同区域的分子发生反应。
所以,一些类胡萝卜素是膜的抗氧化保护剂。
此外,类胡萝卜素分子在膜上的方位也会影响膜的性质。
类胡萝卜素分子能影响膜的厚度、强度和流动性,并影响膜对水、氧气及其他分子的通透性[11]。
b类胡萝卜素与蛋白质分子之间的相互作用:
类胡萝卜素与蛋白质分子之间的相互作用在各种生物中非常常见,具有十分重要的生理功能。
一方面,蛋白质能使类胡萝卜素与其它分子之间保持准确的位置,从而起到稳定类胡萝卜素分子的作用,类胡萝卜素在生物体内时比它单独处于有机溶液中时要稳定得多。
类胡萝卜素通常与蛋白质的疏水区相连,尤其是与脂蛋白中的脂肪成分相连,使得类胡萝卜素能在水环境中被运输并起作用。
另一方面,蛋白质也会改变类胡萝卜素分子的理化性质[12]。
c增加细胞之间的缝间联接交流:
细胞缝间联接交流是指一个细胞输出的信息通过介质传递到另一个产生相应的反应。
细胞间的交流对于多细胞生物体的发生和组织的构建、协调细胞的功能,控制细胞的生长和分裂是必须的。
Bertram等[13]用细胞模型试验证明:
β-胡萝卜素和其它类胡萝卜素可加强细胞与细胞缝间联接交流的能力,从而抵制或降低癌症的发生。
Yamasak[14]也指出:
缝间联接是指邻近细胞间存在着如珍珠串般的连接通道,它是由联接蛋白链形成的,通过它可以产生细胞间的交流。
在转化阶段的癌细胞会由于通道受到破坏而干扰交换,这种交换是控制生长的一种因素,体外促癌物质能通过联接蛋白的基因而抵制交换,在癌症加速阶段联接蛋白基因的表达大大降低。
Wolf[15]证明:
β-胡萝卜素和视黄醇能通过联接蛋白激活或重新活化信息的交换,从而抵制癌症诱导细胞升级到恶化阶段。
1.2类胡萝卜素的分布
类胡萝卜素与叶绿素一起是自然界中最丰富的色素,绝大多数类胡萝卜素呈绚丽的黄色、橙色或红色。
它们存在于绝大多数生物体内,但只能由植物与微生物合成。
在植物中,类胡萝卜素存在于叶绿体和有色体膜上。
动物体内的类胡萝卜素来自于它们摄食的食物中,人的血液中有30~50种类胡萝卜素。
在人们的日常饮食中类胡萝卜素主要存在于深色的以及红黄橙色的蔬菜和水果中[16]。
有很多天然类胡萝卜素来自高等植物橙黄色的花朵,如向日葵、金盏花等,橙红色的果实,如:
番茄、柑橘等以及胡萝卜的根。
但是,类胡萝卜素含量高的是植物和藻类的光合组织。
在这些组织中,类胡萝卜素大量存在于光合作用器官中,而且通常被叶绿素的绿色所遮盖。
只有当叶绿素降解后它们才露出来,如:
秋天的红叶。
估计天然类胡萝卜素的年产量大约有1亿吨。
其中,海藻中的主要类胡萝卜素(岩藻黄质)占1000万吨。
类胡萝卜素曾经被普遍认为是一种植物色素,但是它们也广泛存在于微生物和动物体内,并赋予它们黄、橙红色。
尽管动物自身不能生物合成类胡萝卜素,但是很多动物通过摄取含有类胡萝卜素食物而富有颜色。
例如一些鸟类的羽毛及一些鱼的皮肤和肌肉均由于它们含有胡萝卜素而呈现艳丽的色泽。
1.3-胡萝卜素、辣椒红素及胭脂树橙的性质及生理活性
1.3.1-胡萝卜素的性质及生理活性
a.β-胡萝卜素的性质
β-胡萝卜素(β-carotene)又称叶红素、维生素A原,是一种天然色素,对氧气、光、热敏感[17],是四萜类化合物,分子式:
C40H56,分子量536.88,熔点184℃。
通常为深红色结晶,结构式:
β-胡萝卜素分子中间为4个异戊二烯结构,两端有两个β-紫罗酮环,β-胡萝卜素分子从中心位置发生断裂可生成两分子的维生素A,是最有效的维生素A原。
β-胡萝卜素为外观呈深红色至暗红色、有光泽的斜方六面体或结晶粉末。
因分子中含有双键,遇氧、热和光易发生氧化降解反应,所以应注意保存,一般充氮气后避光-20℃保存。
β-胡萝卜素不溶于水,溶于四氢呋喃、二甲基亚砜、二硫化碳、苯、氯仿、乙烷和植物油等有机溶剂。
b.β-胡萝卜素的生理活性及应用
β-胡萝卜素是维生素A的前体,与维生素C、E一样是强抗氧维
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