免疫学SOP写作参考手册.docx
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免疫学SOP写作参考手册
目录
标本采集与管理1
1血液标本1
2尿液标本2
特种蛋白测定5
1ARRAY分析系统5
2BNP蛋白分析系统8
3免疫分析的质量控制10
4特种蛋白检测的注意事项13
4特种蛋白的临床意义14
5特种蛋白检测后事务处理23
自动化电泳技术24
1血清蛋白电泳24
2血清免疫固定电泳28
3尿蛋白电泳技术33
4自动化电泳技术的质量控制37
5蛋白电泳检测后事务处理40
T淋巴细胞Ag-NORs检测42
1Ag-NORs测定的基本原理42
2测定方法42
3T淋巴细胞Ag-NORs检测的临床意义43
4注意事项与影响因素44
5Ag-NORs检测结果及报告时间45
淋巴细胞亚群分析46
1检测原理(流式细胞术)46
2淋巴细胞亚群分析试剂46
3淋巴细胞亚群分析操作步骤46
4淋巴细胞亚群检测注意事项48
4淋巴细胞亚群分析临床意义49
5淋巴细胞亚群检测时间及报告50
标本采集与管理
1血液标本
1.1采血标本的选择
1.1.1生物钟周期的影响
人体内有许多系列化指标在一日内会出现周期性变化,因此采用适当时段的血标本对特种蛋白的检测是至关重要的。
1.1.2饮食、饥饿
饮食对生化指标的影响取决于饮食中的成分及进食与采血时间的间隔,如果禁食时间太长又可引起部分特种蛋白指标偏低如补体C3、前白蛋白及转铁蛋白等。
1.1.3运动
运动后由于出汗和呼吸加快,体液的量及分布发生改变,使部分生化指标偏高。
1.1.4某些诊断手段的影响
有些诊断和治疗手段也可对检验结果产生影响,主要包括:
外科手术,输液或输血,穿刺或活检等。
患者在外科手术后可使C反应蛋白升高及白蛋白下降。
1.2.5体位
人的体位改变可引起血液中许多指标发生变化。
例如,从仰卧到直立时,由于血浆容积的重新分布,大多数生化物质从仰卧到直立增高5~15%如免疫球蛋白。
1.2标本处理
1.2.1血清和血浆
由于一些技术性和生理方面的原因,血清和血浆中某些生化指标会有所不同。
一般来说,作特种蛋白分析的血液标本多数都采用血清标本如作蛋白电泳分析时血浆中常因纤维蛋白原出现在γ-球蛋白区带而干扰实验结果。
1.2.2标本的保存
标本采集后应立即送检,不能送检的标本应在合适的环境下保存。
一般血液标本应首先分离血清,分离的血清常存放在4℃环境中。
血液标本放置时间过长,C-反应蛋白测定结果偏低。
一般情况下,血液标本从采集到送检不能超过1小时,实验室则应对送检的标本及时检验,免疫学检验标本应在冰箱保存2天。
1.3实验室验收血液标本的标准
1实验申请单(化验报告单)应清楚填写下列内容:
病人姓名、性别、年龄、科别、床号、病案号、住院号、申请序号、标本类型、临床诊断或主要症状、采集标本时间、实验室接收时间及申请检查的实验项目。
2血液标本容器标签填写内容应与实验申请单的内容完全一致。
3不同检测技术需要不同的血液标本种类,血液标本量不能少于最低检测量。
4血液标本特殊检测应在规定的时间内送检。
1.4实验室拒收血液标本的标准
1实验申请单(化验报告单)填写的内容需与标本标签填写内容完全一致,否则拒收。
2实验申请单(化验报告单)与标本标签应填写清晰,易于辨认和识别,否则拒收。
3重度脂血、溶血的血标本,标本含量不足2.5ml者,拒收。
4实验申请单(化验报告单)和标本容器受标本玷污者,拒收。
5T淋巴细胞Ag-NORs检测标本应采用肝素抗凝,标本凝固、标本量不足1.0ml或溶血者,拒收。
淋巴细胞亚群检测标本应采用EDTA抗凝,送检时间每周三上午8:
00~9:
00,标本凝固、溶血和标本采集超过2小时者,拒收。
2尿液标本
2.1收集尿液容器
收集尿液标本的容器多种多样,留取标本最基本的要求是使用清洁、干燥、方便的容器。
无论采用何种容器,都必须满足下列要求:
1送检尿标本容器上应用标签,并注明病人的姓名、科别、床号、收集标本的时间及检测项目。
2容器只限一次性使用、清洁,不含有干扰实验的物质,如做细菌培养应使用无菌瓶。
3所用容器至少可容纳50ml尿液,开口应大于4cm,底部要宽,以防止尿液溅出。
4容器应方便运输,便于保存。
5对于儿科患者,特别是新生儿,可使用小型、特殊的容器。
2.2尿液标本的种类
2.2.1首次晨尿标本、随机尿标本
收集早晨起床后的第一次和随机留取任何一个时间的尿液标本,不受条件的限制,此类标本容易获得,适合尿液常规检查和β2-微球蛋白检测。
2.2.212小时尿标本
即患者正常进食,晚上8点排空膀胱的尿液,再收集以后12小时内所有尿液标本,用于微量白蛋白排泄率测定。
2.3.324小时尿标本
病人于早晨8点排空膀胱的尿液,再收集以后24小时内所有尿液标本。
此标本用于体内代谢产物的定量检测,如各种蛋白定量检查。
2.3收集尿标本的注意事项
1临床医护人员和实验室工作人员应指导病人正确留取尿标本的方法。
2容器应清洁干燥。
3女性病人应避免在月经期留取尿标本,防止混入阴道分泌物;男性则要避免前列腺或精液混入,必要时冲洗外阴后留取中段尿或导尿。
4新生儿及婴幼儿收集尿标本时,应注意用0.1%新洁尔灭消毒尿道口、会阴部,然后将洁净的标本瓶紧贴尿道口收集尿标本或采取特殊留尿方式。
5标本留取后应立即送检,不能立即送检的标本应妥善保存。
6应根据不同实验要求,留取不同种类的尿液标本及采用不同的取样方式。
每次收集尿标本量应不小于50ml,以备标本的重复检测。
7注意防腐剂使用的种类、使用的方式,并嘱咐病人注意防腐剂对自已的伤害。
2.4实验室验收尿液标本的标准
1实验申请单(化验报告单)应清楚填写下列内容:
病人姓名、性别、年龄、科别、床号、病案号、住院号、申请序号、标本类型、临床诊断或主要症状、应用的药物、收集标本时间、实验室接收时间及申请检查的实验项目。
2尿标本容器标签填写内容应与实验申请单的内容是否完全一致。
3尿液标本种类、尿量,符合所申请实验的要求。
4尿液及时送检并实施了相应的正确防腐措施。
5收集尿标本的容器、收集尿标本的过程,符合实验要求。
2.5实验室拒收尿液标本的标准
1实验申请单(化验报告单)填写的内容必须与尿液标本容器标签填写内容完全一致,否则拒收。
2尿液特种蛋白检查的标本必须在留取标本后2小时之内送到,否则拒收。
3申请尿液特种蛋白排泄率检查的标本必须是规定时间内全部尿液的混合液,并准确记录尿量,否则拒收。
4特种蛋白检测的尿液量应大于5ml,否则拒收。
5送检的申请单和容器应清洁卫生,送检的申请单和容器不能溅有标本,否则拒收。
特种蛋白测定
1ARRAY分析系统
1.1测定原理
ARRAY360特种蛋白分析系统采用激光速率散射比浊法:
它是将抗原抗体的沉淀反应与散射比浊分析技术相结合,对单位时间内抗原与抗体的速度进行动力学测定。
当抗体的浓度固定于一定范围内时,速度峰值的高低与抗原的含量成正比,随着时间的延长,免疫复合物的量逐渐增多,抗原抗体结合的峰值在一定时间出现。
不同抗原含量的样本其速率峰值是不同的,通过微机处理可得到待测蛋白成分的含量。
速率散射免疫比浊法测定最大优点在于快速,检测过程中不必去掉本底散射值的干扰,也不受本底散射值的影响,这无颖增加了准确性,扩大了免疫学检测范围。
1.2操作方法
1.2.1仪器的开机
1在开机之前,先检查各种试剂量及废液瓶。
2依次打开主机、电脑、显示器、打印机电源开关。
3当电脑屏幕出现“CONTIUNE”信息时,按[F1]键,屏幕出现“PLACESYSTEMDISK1INDRIVEANDPRESSTHEENTERKEY”插入第一张系统盘,按[ENTER]确认,仪器将程序装入系统内存(大约需时1分钟),屏幕再次出现“PLACESYSTEMDISK2INDRIVEANDPRESSTHEENTERKEY”请取出第一张系统盘,插入第二张系统盘,按[ENTER]确认,仪器将程序装入系统内存(大约需时1分钟),程序装载完毕后,仪器开始启动,完成初始化,打印出各种试剂定标信息。
1.2.2仪器光路的检查
在每天进行测试之前,应该对仪器的左、右外光路进行检查,其左光路检查方法如下:
1在“MASTERSCREENS”屏下按[F4](SYSTEMSETUP)键,再按[F2](OPTICSUPDATE)键,再按[F1](LIFTOPTICS)键;屏幕出现“Drainingopticsflowcell”信息时,仪器自动排空流动池内的液体;
2屏幕出现“Removetheflowcellandreplacewiththe120cell,press[ENTER]tocontinue”信息时,用120校正单元替代流动池,按[ENTER]确认;
3屏幕出现“Readingscatterstandard”信息,仪器正在读取散射光120单元校准,当读取完毕后,仪器屏幕出现“Replacethe120cellwiththeblackcell,press[ENTER]tocontinue”信息时,用黑棒替代120校正单元,按[ENTER]确认,仪器正在读取散射光;
4屏幕出现“Removetheblackcellwithflowcell,press[ENTER]”信息时,用流动池替代黑棒,按[ENTER]确认。
5检测完毕后,仪器屏幕会出现左光路外光路散射读取的结果(FILTEEDREDSCATTERREADING)。
GAIN1、2和3的结果必须为120±3,GAIN4的结果必须为“OVER”;ADJUST%的范围必须为±15。
如果仪器ADJUST%的范围超过±15则要进行内光路设置(OPTICSSET)。
重复此过程对右光路进行检查。
1.2.3常规操作
测定样本项目必须在仪器校准通过的情况下,且每天测试前对仪器的外光路进行检查通过后才能进行样品测定,其操作过程:
1在“MASTERSCREENS”屏下按[F1](Sampleprogram)键;
2屏幕出现“[SELECT]tochangereagentwheel,[ENTER]toaccept”信息时,通过[SELECT]键选择所需试剂盘号,按[ENTER]确认;屏幕出现“Enterasinglenumberorset(i.e.1-5,8),Novaluecanexceed40.”信息时,在CUP上输入所测定样本杯号(可以是单个号或一批号,但数字不超过40),按[ENTER]确认;屏幕出现“Entertextthenpress[ENTER]”信息时,在SAMPLEID上输入病人的ID号,按[ENTER]确认;屏幕出现“Enterasinglenumberorset(i.e.1-5,8),Novaluecanexceed9.”信息时,在PANEL输入所测定的一批样品项目的组合号,但数字不超过9(可以通过[F2](selectpanels)键直接察看和选择试验组合的序号),按[ENTER]确认;屏幕出现“Enterasinglenumberorset(i.e.1-5,8),Novaluecanexceed20.”信息时,在CHEM输入所测定样品项目的序列号,但数字不超过20,按[ENTER]确认;屏幕出现“[SELECT]tochangechoice,thenpress[ENTER]”信息,在SEX通过[ENTER]选择病人的性别,按[ENTER]确认;屏幕出现“Enteranumber0and99”信息时,在AGE输入病人的年龄,按[ENTER]确认;
3通过[F7(Nstddil)]选择病人标本的稀释度,通过[F8(Fluidagxs,pts)]选择病人标本的种类和是否需要抗原过量检测,通过[F3(Prioritysample)]选择病人标本的优先权,通过[F6(Programsummary)]察看所有病人标本输入测试项目是否正确后,按[F1(Savecup)]存盘。
4检查所有试剂的批号,试剂、各种液体的体积及各种试剂位置;确认后按主菜单键,再按两次“START”键进行校准,按[F7]键监视仪器运转情况。
1.2.4仪器的标准
仪器在进行标准之前必须对仪器的光路进行设定(OPTICSSET),操作过程:
1在“MASTERSCREENS”屏下按[F4](SYSTEMSETUP)键,再按[F3](Opticsset)键,再按[F1](LEFTOPTICS)键;屏幕出现“Drainingopticsflowcell”信息时,仪器自动排空流动池内的液体;
2屏幕出现“Removetheflowcellandreplacewiththeblackcell,press[ENTER]tocontinue”信息时,用黑棒替代流动池,按[ENTER]确认;
3屏幕出现“Locatingbaselingnullingpoint”信息,仪器正在设置散射基准点,当读取完毕后,仪器屏幕出现“Replacetheblackcellwiththe120cell,press[ENTER]tocontinue”信息时,用120校正单元替代黑棒,按[ENTER]确认;
4屏幕出现“Locatinggainsetting”信息,仪器正在设置Gain1、Gain2和Gain3的散射,当读取完毕后,仪器屏幕出现“Replacethe120cellwiththeblackcell,press[ENTER]tocontinue”信息时,用黑棒替代120校正单元,按[ENTER]确认;
5屏幕出现“Locatingoffsetsettings”信息,仪器正在设置Gain4散射基准,当读取完毕后,仪器屏幕出现“Replacetheblackcellwiththe120cell,press[ENTER]tocontinue”信息时,用120校正单元替代黑棒,按[ENTER]确认;
6屏幕出现“Locatinggainadjustmentfactors”信息,仪器正在调整Gain的散射因数,当读取完毕后,仪器屏幕出现“Opticssetdone.Replaceoldopticssetvalues?
”信息时,按[F1]确认,按[F2]取消。
7屏幕出现“Replacethe120cellwithflowcell,press[ENTER]”信息时,用流动池替代120校正单元,按[ENTER]确认,光路校准完毕。
必须进行仪器对试剂卡和校准卡的读取和仪器校准两方面,操作步骤:
1在“MASTERSCREENS”屏下按[F2](CalStatus)键;
2在“CalibrationStatusScreen”屏出现“Movecursortodesiredtest,[SELECT]tochangereagant,[ENTER]toaccept”信息时,通过游标和[SELECT]键选校正试验项目,确认;
3按[F1](ReadABcards)键读取试剂卡,屏幕出现“Insertcardincardreader”信息时,插入试剂卡到仪器读卡器,读卡完毕按[F1]键确认;
4当所有试剂卡都读取完毕后,按[F2]键读取抗体卡:
首先确认校准试剂的位置,然后插入抗体卡,读取抗体卡信息,按[F1]键确认;
5检查所有试剂的批号,试剂、各种液体的体积及各种试剂位置;确认后按主菜单键,再按两次“START”键进行校准,按[F7]键监视仪器运转情况。
6在每次对仪器定标之前,应仔细核对试剂卡上试剂批号与试剂的批号,校正卡上校准液批号与校准液的批号,使其完全一致后才能进行校准仪器,否则会因批间校准液定标浓度差异而导致试验结果的误差。
类风湿因子的校正试剂应放在试剂盘的中孔。
1.25仪器的关机
1在“MASTERSCREENS”屏下按[F4](SYSTEMSETUP)键,再[F](Prime)键进行清洗程序,根据仪器要求选择“1、2、3或4”,再按“SELECT”键,最后按“PREVSCREEN”键进行清洗(约需时6分钟),结束清洗后可关掉主机、电脑、打印机电源。
1.3ARRAY分析系统检测范围
免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白轻链κ、免疫球蛋白轻链λ、补体C3、补体C4、α1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、铜蓝蛋白、类风湿因子、C-反应蛋白、微量白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白等。
2BNP蛋白分析系统
2.1测定原理
BNP特种蛋白分析测定系统实质上是透射比浊的一种改良,利用发光二极管(840nm)作为光源,检测在前向角130~240的散射光,由硅化光电二极管接收散射光信号,这种散射光的强度与免疫复合物浓度成正比。
散射光电信号与贮存在计算机内的标准曲线进行比较,然后转换成检测物的浓度单位。
2.1.1固定时间测定法
BN100分析仪可以通过固定时间来检测血清特种蛋白浓度。
固定时间法是利用两个时间光散射检测之间的差异,首先在免疫反应混合物预温10秒钟后测定第一次光散射的值(t1),然后在反应6分钟后测定第二次光散射的值(t2)。
这两点光散射强度的差异通过贮存在计算机内校准曲线进行比较,即可得出该物质的浓度。
BN100分析仪不需要抗原过量检测,制造商使用了较宽的检测范围以保证检测血清最大的可行性范围。
2.1.2终点检测法
BN100分析仪通过终点法来检测用胶乳反应的血清特种蛋白浓度,终点法是检测预温30分钟后光散射的值(t1)。
因为胶乳颗粒具有较高的试剂空白值,所以测定空白值没有必要。
通过终点光散射强度与贮存在计算机内校准曲线进行比较,即可得出该物质的浓度。
免疫胶乳浊度测定法为一种带载体的免疫比浊法,其敏感度大大高于比浊法,操作也极为简便。
选择一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒,吸附抗体(IgG)后,当遇到相应抗原时,则发生凝集。
单个胶乳颗粒在入射光波长之内,光线可透过。
当两个胶乳颗粒凝集时,则使透过光减少,这种减少的程度与胶乳凝聚成正比,当然也与抗原量成正比。
2.2操作方法
2.2.1仪器的开机
先打开BNPROSPECSYSTEM分析仪的电源开关,在打开电脑主机、显示屏的开关,最后打开打印机的开关。
2.2.2仪器的关机
在主菜单下选择[STATUS]键,在此屏下选择[EXIT]键或在键盘上选shift+f12。
出现对话框“shutdowntheanalyzer
Yes:
theanalyzerwillshutdownandtheviewersoftwarewillend.
No:
Onlytheviewersoftwarewillend.”
关机选择[yes],分析仪进行自动冲洗。
然后回到主屏。
关掉分析仪电源,再关掉电脑主机、显示屏。
2.2.3仪器的定标
在主菜单下选[calibration],从分析列表中选则你要校正的项目,然后从试剂列表中选择相应试剂。
把标准品放到相应的位置,按[mesure]开始进行校正。
因试剂的批号不同,所以每换一批试剂需重新定标;同一批号的试剂需30天校正一次。
2.2.4质控
为保证结果的准确性,每天测定标本之前要进行质控。
将质控物放在质控架上,装入分析仪内。
按[labjournal]键,进入后选择右边的[controlrequests]键。
选择所要做的质控项目,按[measure],开始测定。
2.2.5标本测量
1.标本的准备
将待测标本离心,保证足够的血清待测。
将标本编号顺序放入标本架上。
2.标本检测前仪器的准备
在主菜单下按[stastus]键,检查仪器所需液体(缓冲液、稀释液、冲洗液)是否足够,若仪器提示不足则需更换,更换后进行冲洗。
具体操作:
在主菜单下选[system],进入此画面后,按[systemliquideandprime]键,选择你要更换的液体,按[save],仪器开始自动冲洗。
检查试剂是否足够,若不够,打开新包装的试剂更换,按[loading]键,连续按[rengent],[graphic]键,点击所要更换的试剂,然后按[acess]键,打开仪器右盖,把试剂放入相应位置.关上右盖,按[close],仪器自动识别试剂的条形码。
检查稀释杯和反应杯是否足够,把已用过的替换掉,操作步骤如下:
在主菜单下选[system],进入此画面后,按[cuvettes&dilutioncups]键,进入后按[dilutioncups]或[cuvettes],按[selectall],[save],仪器提示打开右盖,更换稀释杯或反应杯,关上右盖,按[close]键。
3.患者信息输入
在主菜单下按[labjoural],进入此画面后按[new]键,出现对话框,在sampleID处输入标本号,在batchinput处输入标本个数(相同检测项目),在下面的specimantype处输入需要测定的项目,选择多个项目时:
左手按住ctrl键,右手可选多个检测项目。
输入完毕后,在主菜单下选[loading],屏幕上会出现标本架的位置,然后根据标本及标本号分别对应好。
4.测定开始
显示屏右上角提示测定所需时间。
5结果
测定晚毕后结果出现在屏幕上,可通过打印机打印。
2.3BNP分析系统检测范围
β2-微球蛋白、超敏C-反应蛋白、免疫球蛋白E。
3免疫分析的质量控制
3.1免疫分析前质量控制
3.1.1标本处理
1收到样本后应注意
样本是否符合项目要求。
一般情况下,免疫学试验可用血清、分离胶处理的血标本及各种体液标本。
标本量是否足够,标本量不足很难完成其申请项目,尤其是用仪器进行检测时一般要求重新送标本。
查看标本标签与申请单标签是否相符。
2标本编号
免疫学编号时根据情况系列编号,最好能做到每份样本1个惟一编号,以免标本放错导致检测结果的错误。
3.标本离心
用于免疫学实验的样本一般离心为普通离心机2000rpm/min,5分钟。
离心后的标本要求血清或血浆非常清亮,标本完全无纤维蛋白丝,否则容易导致仪器检测时塞针使检测仪器故障或检测结果失真。
血脂标本一般情况下影响免疫特种蛋白检测结果。
溶血标本的争议比较大,进口试剂多数在小于10g/L的血红蛋白量时不受影响。
4标本的保存
对于不能立即检测的标本,要按规定进行保存。
一般情况下,免疫学特种蛋白检测的标本采用冰箱保存即可。
3.1.2仪器与试剂
免疫特种蛋白试验的好坏,很大程度上取决于仪器与试剂的质量。
因此实验室在购买试剂时,最好多找几个公司的仪器与试剂进行比较,然后选出灵敏度和特异性都比较满意的仪器与试剂。
同时也应注意试剂的批间差,应该非常小而不影响检测结果,如果采用仪器法是一步法的试剂,还应注意HOOK效应,应了解试剂的线性范围及HOOK效应的浓度。
3.1.3实验环境
1环境温度
良好的环境温度是实验室免疫学检测的基础,室温一般指22~28℃。
仪器虽有自动恒温控制,但如果实验室温度过低或过高,均会超出仪器控制范
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