细菌与真菌学实验 指导书.docx
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细菌与真菌学实验指导书
细菌与真菌学实验
实验一细菌形态结构观察
【目的】
1、了解细菌的基本形态和特殊结构观察法
2、明确细菌特殊结构在医疗实践中的意义
3、细菌不染色标本的观察方法
4、观察活细菌的形态及运动情况
【材料】革兰染色标本片:
1、球菌:
葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。
2、杆菌:
伤寒沙门菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。
3、螺形菌:
霍乱弧菌或水弧菌。
细菌特殊结构标本片:
1、鞭毛:
变形杆菌、霍乱弧菌
2、荚膜:
肺炎链球菌、产气荚膜杆菌
3、芽孢:
破伤风杆菌、炭疽杆菌
细菌动力观察材料:
1、菌种:
普通变形杆菌、表皮葡萄球菌。
2、变形杆菌和表皮葡萄球菌8~12min肉汤培养物。
3、其他:
凹玻片、盖玻片、凡士林、牙签、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸
一细菌形态结果观察
1、使用油镜观察上述革兰染色标本片:
认识细菌的三种基本形态。
注意观察各菌的形态、大小、排列方式及染色性等特点。
2、使用油镜观察细菌的特殊结构标本片:
(1)荚膜:
肺炎链球菌经革兰染色后,呈矛头状成双排列,菌体四周有不着色的透明圈(既荚膜);肺炎链球菌与产气荚膜杆菌的荚膜(荚膜染色法),注意观察菌体及荚膜的颜色及两者的形态特点。
(2)鞭毛:
变形杆菌与霍乱弧菌的鞭毛(鞭毛染色法),注意观察菌体和鞭毛的颜色、鞭毛的长短、数目及在菌体上的位置。
(3)芽胞:
破伤风梭菌及炭疽杆菌芽胞(芽胞染色法),注意观察菌体、芽孢的形态、颜色及芽孢在菌体中的位置。
二、细菌不染色标本观察法(动力观察法)
1、悬滴法
图2-1-1
(1)取一张洁净盖玻片,用牙签涂少许凡士林于盖玻片的四个角处。
(2)用接种环取3~4环普通变形杆菌或表皮葡萄球菌液体培养物于盖玻片中央。
(3)把凹玻片凹面朝下盖在盖玻片上,使凹窝中央正对菌液(见图2-1-1)。
(4)迅速翻转凹玻片,使粘附在凹玻片上的盖玻片朝上。
(5)先用低倍镜观察,再换高倍镜观察。
图2-1-1悬滴法普通变形杆菌有鞭毛,运动活泼,可向不同方向迅速运动。
表皮葡萄球菌无鞭毛,不能作真正运动,只能在一定范围内作移位不大的颤动,这是受水分子撞击而呈分子运动(即布朗运动)。
2、压滴法
(1)用接种环取3~4环菌液于洁净载玻片中央。
(2)用小镊子挟一块盖玻片轻轻覆盖在载玻片的菌液上,放置盖玻片时,应将盖玻片的一端接触载玻片,然后缓慢放下,以免菌液中产生气泡。
(3)先用低倍镜对光找到细菌的位置,再换高倍镜观察细菌的运动。
【思考题】
1、在油镜下你看到了细菌有几种特殊机构?
能否看到细菌菌毛?
2、细菌特殊结构在医学上有何意义?
3、细菌的动力检查有何意义?
实验二细菌涂片标本的制备及革兰染色法
【目的】1、掌握细菌涂片标本的制备和革兰染色法。
2、了解革兰染色法的意义。
【原理】
1、细胞壁结构学说:
革兰阳性菌细胞壁结构较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易渗入;革兰阴性菌细胞壁结构疏松,肽聚糖层薄,含大量脂质,乙醇容易渗入。
2、等电点学说:
革兰阳性菌等电点(pH2~3)比革兰阴性菌等电点(pH4~5)低,在相同pH条件下,革兰阳性菌所带负
电荷比革兰阴性菌多,故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固,不易被95%乙醇脱色。
3、化学学说:
革兰阳性菌菌体含有大量核糖核酸镁盐,可与碘、结晶紫牢固结合成大分子复合物,使已经着色的细菌不被95%乙醇脱色;革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少,故容易被95%乙醇脱色。
【材料】
1、菌种:
大肠埃希菌、葡萄球菌。
2、染液:
革兰染色液一套:
结晶紫染液、碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红染液。
3、玻片、生理盐水、酒精灯、吸水纸、接种环、玻璃蜡笔、香柏油等。
【方法】
一细菌涂片制备
1、涂片:
取一张洁净载玻片,用玻璃蜡笔在洁净载玻片上标记,于玻片两端各滴1滴生理盐水,不要太靠近玻片边沿。
接种环在火焰上灭菌后,分别挑取少量葡萄球菌和大肠埃希菌于玻片两端的生理盐水中,并研磨成均匀混浊的菌液(如系液体标本,则不需加生理盐水,可直接涂于载玻片上),涂成约1cm×1cm大小的均匀薄膜,接种环灭菌后放回试管架上。
2、干燥:
涂片最好在室温下自然干燥,如欲加速干燥,也可将涂膜背面置火焰上方不烤手的高处略加烘烤,但切勿紧靠火焰,以免将涂膜烤焦,细菌变形,染色后难以观察。
3、固定:
涂片干燥后,手持玻片的一端,将载玻片的背面往返通过酒精灯火焰三次,共约2~3秒钟,注意温度不可太高,以玻片加温面触及皮肤感觉烫而尚能忍受为度。
固定的目的一是杀死细菌,二是使菌体与玻片粘附牢固,以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉,三是固定后细菌蛋白质变性易被着色。
固定完毕,放置待冷后再进行染色。
注:
无论何种染色,涂片均不可太厚,一定涂成薄膜;取第二个菌之前,一定要注意灭菌,否则两菌混淆;最好取湿润的菌落,便于将细菌混匀。
二革兰染色法
1、初染:
将固定好的细菌涂片放在染色架上,滴加结晶紫染液2~3滴,以全面覆盖涂膜为度,染色1min后用细流水冲洗,将玻片上积水轻轻洒净。
2、媒染:
滴加卢戈(Lugol)碘液数滴,染色1min后用细流水冲洗,将玻片上积水轻轻洒净。
3、脱色:
滴加95%乙醇数滴,轻轻前后摇动玻片数秒钟,使均匀脱色,然后倾斜玻片,使脱掉的染料随乙醇流去,再滴加乙醇,如此反复2~3次,直到流下的乙醇无色或稍呈淡紫色为止,大约30s左右,用细流水冲洗,将玻片上积水轻轻洒净。
4、复染:
滴加稀释石炭酸复红液数滴,复染1min,用细流水冲洗,将玻片上积水轻轻洒净。
待标本片自然干燥或用吸水纸吸干后,在涂菌处滴加一滴香柏油,然后用油镜观察结果。
【结果】染成紫色的为革兰阳性菌;染成红色的为革兰阴性菌。
【注意事项】
1、涂片应均匀,如太厚或太薄,菌体分散不均,会影响乙醇脱色,造成染色结果不准确。
固定时应避免菌体过分受热,否则会使菌体变形影响染色效果。
脱色时应把握好时间,若脱色时间过长易造成假阴性,但脱色时间过短革兰阴性菌也会被误认为革兰阳性菌。
2、所用染色液应防止水分蒸发而影响浓度,特别是碘液久存或受光作用后可形成碘酸,易失去媒染作用。
脱色用的乙醇以95%浓度为好,若瓶口密封不好或涂片上积水过多,均可引起乙醇浓度降低而增强脱色能力。
3、不同时间的细菌培养物,染色结果有差异。
如葡萄球菌,培养48h以上的老龄菌,易染成红色,而幼龄菌则易染成紫色。
细菌染色一般用18~24h的细菌培养物。
4、染色过程中勿使染色液干凅,用水冲洗后应甩去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。
【思考题】
1、为什么接种环(针)使用前后都必须烧灼灭菌?
忽略了有什么危害?
2、制备一张好的涂片应注意些什么?
3、如革兰阳性菌被染成革兰阴性菌可能有哪些原因?
【附录】
1、革兰染色液的配制
(1)结晶紫染液:
称取结晶紫4~8g,溶于95%乙醇100ml中,配成结晶紫乙醇饱和液。
取此饱和液20ml与1%草酸铵水溶液80ml混匀,过滤后备用。
(2)卢戈(Lugol)碘液:
先将碘化钾2g溶于10ml蒸馏水中,再加入碘1g,略加振摇,使之全部溶解后,再加蒸馏水至300ml既成。
2、鞭毛染色法(魏曦染色法)
(1)染液:
甲液:
钾明矾饱和液2ml,50g/L石炭酸液5ml,200g/L鞣酸液2ml,混匀。
乙液:
碱性复红乙醇饱和液。
使用前,将甲液9份,乙液1份混合后过夜,次日过滤后使用,3天内使用效果最佳。
此液不能长期保存。
(2)染色方法:
先将鞭毛菌在肉汤培养基中传代6~7次。
取琼脂斜面培养基吸出凝结水,加入2ml无菌蒸馏水,然后将肉汤中传代的细菌接种于斜面琼脂与液体交界处,再从该交界处向上划一直线,放人温箱中培养16h。
用接种环从交界处取一环菌液,轻轻放人盛有3~4ml蒸馏水的小碟液体表面,使细菌自由分散,浮在液体表面,静置于温箱内4~5min后,用接种环取一环液面混合液放于高度洁净的载玻片上,切勿研磨和摇动,置37℃或室温下让其自然干燥,切勿火焰固定,加数滴染液染色1~2min,轻轻水洗,干后用显微镜油镜观察。
(3)结果:
细菌菌体和鞭毛均染成红色,菌体着色较鞭毛深。
染色时间长则鞭毛粗,否则鞭毛较细。
3、荚膜染色法(黑斯染色法)
(1)染液:
结晶紫染液:
结晶紫饱和乙醇溶液5ml,加蒸馏水95ml混合;200g/L硫酸铜水溶液。
(2)染色方法:
将荚膜菌涂片,在空气中自然干燥,无需加热固定,滴加结晶紫染液,在火焰上微微加热,使玻片上染液冒蒸汽为止。
再用硫酸铜水溶液冲洗,切勿用水冲洗。
待干后油镜检查。
(3)结果:
细菌菌体染成紫色,荚膜染成淡紫色。
4、芽胞染色法(复红美兰法)
(1)染液:
石炭酸复红液,95%乙醇,碱性美兰液(配法:
取美兰2g,溶于95%乙醇100ml中配成美兰乙醇饱和液。
取此饱和液30ml与0.0l%KOH水溶液100ml均匀混合即成)。
(2)染色方法:
将有芽胞的细菌培养物涂片,自然干燥后,火焰固定。
滴加数滴石炭酸复红染液于涂片上,并用微火加温,使染液冒蒸汽,持续5min,冷却后用流水轻轻冲洗;用95%乙醇脱色2min,流水轻轻冲洗;再加数滴碱性美兰染液复染0.5min,流水轻轻冲洗,干后油镜检查。
(3)结果:
细菌菌体染成蓝色,芽胞染成红色。
实验三常用培养基制备
【目的】
1、熟悉培养基制备的基本程序。
2、掌握常用培养基的种类及用途。
【材料】1、试剂:
牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、脱纤维绵羊血或兔血、蒸馏水、1N的NaOH、1N的HCl等。
2、器材:
三角烧瓶、量筒、精密pH试纸、天平、高压蒸气灭菌器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿、酒精灯、电炉、血清凝固器等。
【方法】
一培养基制备的基本程序
制备一般培养基的基本程序可分为:
调配、溶化、矫正pH、过滤、分装、灭菌、鉴定和保存等步骤。
1、调配:
按培养基组成准确称取各成分用量,放人三角烧瓶或大容量烧瓶中,加一定量蒸馏水,振摇后使其充分混匀。
应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。
2、溶化:
将调配好的混合物在电炉上加热,随时搅拌,防止外溢,使其完全溶化。
溶化完毕,注意补足失去的水分。
3、矫正pH:
可用pH比色法或精密pH试纸,矫正培养基的pH,pH矫正方法见附录,一般将培养基的pH调至7.2~7.6左右。
经高压灭菌后,其pH值约降低0.1~0.2,故在矫正pH时应比实际需要的pH高0.1~0.2。
4、滤过:
自配的培养基通常有一些混浊或沉淀,需滤过澄清后方可使用。
液体或半固体培养基常用滤纸过滤,固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。
如称取的为半成品成分则不需要过滤。
5、分装:
根据需要将培养基分装于三角烧瓶或试管等。
(1)基础培养基:
一般分装于三角烧瓶内,灭菌后备用,以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等;
(2)琼脂斜面:
通常在熔化后分装于试管,量约为试管高度的1/4~1/3,加塞后灭菌,趁热摆成斜面,斜面长度约为试管长度的2/3,且保持试管下端有lcm柱高;
(3)半固体培养基:
分装量约为试管容量的1/4~1/3,加塞灭菌后趁热直立,凝固待用;
(4)琼脂高层培养基:
分装量约为试管长度的1/3,灭菌后趁热直立凝固待用;
(5)液体培养基:
分装量约为试管长度的1/3,灭菌后趁热直立待用;
(6)琼脂平板:
先将灭菌加热熔化后的固体培养基,冷至50℃左右,以无菌操作倾注于无菌平皿内。
内径9cm的平皿约13~15m1,若内径7cm的平皿约7~8m1,轻摇平皿,使培养基平铺于平皿底部,待凝固后将平皿翻转,置4℃保存备用。
6、灭菌:
(1)高压蒸汽灭菌:
耐热物质配制成的培养基(如普通培养基等)常用高压蒸气灭菌,通常压力在103.43kPa(1.05kg/cm2)蒸气压力下,温度达到121.3℃,维持15~30min;含糖培养基加热10磅(68.95kPa/cm2、115.6℃),10~15min为宜,以免破坏糖类物质。
(2)间歇灭菌:
不耐高热的物质配制成的培养基,如糖类、明胶和牛乳等常用间歇灭菌,方法是用流通蒸汽法加热100℃30min,置37℃温箱内过夜,第二天再加热100℃30min,连续三次。
7、鉴定:
培养基鉴定的基本要求是:
①无菌试验:
将灭菌后的培养基置37℃温箱中培养24h,无任何细菌生长为合格。
②效果试验:
将已知菌种接种至此培养基上,证明相应的细菌可在此培养基上生长,且形态、菌落、生化反应等特征典型。
8、保存:
制备好的培养基应注明名称、制作日期,用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内,以减少水分蒸发,存放于4℃冰箱或冷暗处保存备用。
琼脂平板应将底朝上,盖朝下放置;液体培养基应直立放置。
二常用培养基的种类、制备及用途
根据各种细菌生长繁殖时所需要的条件不同,培养基可分为很多种类。
常用的种类按物理性状分:
液体培养基、固体培养基、半固体培养。
按用途不同分:
基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基及厌氧培养基等。
1、液体培养基
(1)肉膏汤培养基成分:
牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g蒸馏水1000ml
制法:
1)用天平分别称取牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g置三角烧瓶中。
2)加入蒸馏水1000ml,把三角烧瓶在电炉上加热,使蛋白胨等溶化。
3)测定培养基的酸碱度,用1N的NaOH调pH至7.4~7.6,煮沸3~5min,必要时滤过。
4)分装试管或烧瓶,加塞,用牛皮纸包扎管口、瓶口。
5)高压蒸气灭菌15磅20min取出冷却后,置4℃冰箱贮存备用。
用途:
肉膏汤培养基可供营养要求一般的细菌生长。
(2)肉汤培养基
成分:
新鲜牛肉500g蛋白胨10g氯化钠5g
制法:
1)将新鲜牛肉去除筋和脂肪,切碎绞细,加水1000ml,置4℃冰箱过夜。
2)次日取出,搅拌均匀,加热100℃30min,用数层纱布或滤纸过滤,补足失去的水分。
3)加入蛋白胨10g,氯化钠5g,加热溶化。
4)冷至50℃左右,矫正pH至7.4。
5)分装试管或烧瓶,加塞,用牛皮纸包扎管口、瓶口。
6)高压蒸气灭菌15磅20min取出冷却后,置4℃冰箱贮存备用。
用途:
作基础培养基使用,营养比肉膏汤培养基好,可供营养要求一般的细菌生长。
2、普通琼脂培养基
成分:
肉汤或肉膏汤1000ml琼脂20~30g
制法:
(1)将琼脂加入肉汤或肉膏汤中,加热溶化。
(2)矫正pH至7.4,分装于试管或三角烧瓶中,每管约5ml。
(3)高压蒸气灭菌15磅20min。
(4)取出试管,斜放使其凝成斜面培养基。
(5)将已溶化的肉汤或肉膏汤琼脂冷至50℃左右,以无菌操作注于无菌平皿中。
内径9cm的平皿约13~15m1,若内径7cm的平皿约7~8m1,厚度约3~4mm。
凝固后即反转过来,底向上,以免在平皿盖上积存凝结水,冷后置4℃冰箱保存备用。
用途:
普通琼脂培养基用于一般细菌的分离培养,纯种接种或保存菌种。
3、血液琼脂培养基
成分:
普通琼脂培养基100ml无菌脱纤维绵羊血或兔血8~10ml
制法:
(1)取已制备好的无菌普通琼脂100ml,加热溶解并冷至50℃左右。
(2)在已消毒的无菌室内打开瓶口,瓶口通过火焰杀死瓶口外的杂菌,用无菌吸管吸取8~10ml血液(临用前置37℃水浴箱预温30min),加入100ml普通琼脂培养基内,轻轻摇匀。
(3)在无菌条件下,倾注于无菌平皿中,冷凝后即成血琼脂平板培养基。
凝固后即反转过来,底向上,置4℃冰箱保存备用。
用途:
血液琼脂培养基用于分离培养或保存营养要求高的细菌,如链球菌、肺炎链球菌等。
4、巧克力色培养基
成分:
同血液琼脂培养基制法:
(1)同血液琼脂培养基,但在培养基中加入血液混匀后,须再置80℃水浴轻轻摇匀10~15min,使血液由鲜红色转变为巧克力色。
(2)冷至50℃左右,倾注于无菌平皿中,冷凝后即成巧克力色培养基。
(3)凝固后即反转过来,底向上,置4℃冰箱保存备用。
用途:
巧克力色培养基主要用于分离培养奈瑟菌属、嗜血杆菌属等。
5.半固体培养基
成分:
肉膏或肉膏汤1000ml琼脂2.5~5g
制法:
(1)将2.5~5g琼脂加到1000ml肉膏汤中,加热熔化,矫正pH至7.4。
(2)分装于小试管中,每管约2~3ml,加塞。
(3)高压蒸气灭菌15磅20min。
(4)冷却后4℃冰箱保存备用。
用途:
半固体培养基用于保存菌种或观察细菌的动力。
6.SS培养基(见肠道菌)
【思考题】培养基的制备程序可概括划分为那几个步骤来完成?
【附录】
1、常用指示剂的配制:
指示剂的种类繁多,可按需要选择所需的指示剂。
在矫正培养基的pH时,一般多用酚红或溴麝香草酚蓝为指示剂。
(1)0.2g/L酚红指示剂的配制:
称取酚红0.lg,置于研钵中,一边研磨一边加入0.01mol/LNaOH溶液28.2ml,然后加蒸馏水使其总量为500ml即成,用于pH的测定。
(2)0.4g/L溴麝香草酚蓝指示剂的配制:
称取溴麝香草酚蓝0.4g,在研钵中随研随加0.1mol/LNaOH溶液6.4m1,然后加蒸馏水至100ml,即为4g/L溴麝香草酚蓝贮存液。
贮存液加蒸馏水作10倍稀释即为0.4g/L溴麝香草酚蓝指示剂,用于矫正pH值。
2、矫正培养基pH
图2-3-2比色架1.培养基管
2.标准比色管3.测定管4.蒸馏水管
取与标准管同口径的试管(通常用华氏试管)3支,于第1、3管各加入欲矫正pH的培养基5ml,并在第一管中加入0.2g/L酚红液0.25ml作为测定管,混匀。
第2管中加入蒸馏水5ml,第4管为标准pH比色管。
4个试管分别按图2-3-2插入比色架中进行比色。
若测定管中培养基过酸或过碱(多为偏酸),可用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl矫正,直到测定管颜色与标准比色管颜色相同为止。
加酸或加碱时要缓慢、准确,每加一滴后要充分混匀,比色后再加一滴,准确记录加入的量。
计算:
设5ml培养基矫正pH7.4需0.1mol/LNaOH0.15ml,现制培养基1000ml,需加NaOH量为:
5:
1000=0.15:
XX=(0.15×1000)/5=30ml若将0.1mol/LNaOH换算成lmol/LNaOH,则需3ml。
培养基中加入所需NaOH后,充分混匀后,再测一次pH,如仍未达到所需求的pH值,再按以上法加以矫正。
实验四细菌的培养及生长现象观察
【目的】
1、熟悉细菌的培养方法。
2、掌握平板、斜面、液体和半固体培养基等接种方法。
3、掌握细菌在液体、固体、半固体培养基中生长现象和意义。
一细菌的接种技术
【材料】
1、菌种:
葡萄球菌和大肠埃希菌混合液、痢疾志贺菌、枯草芽胞杆菌、链球菌。
2、培养基:
液体(肉汤)、半固体、固体(琼脂平板和斜面)培养基。
3、其他:
接种环、接种针、酒精灯等。
【方法】
1、平板划线接种法:
主要用于临床标本中混杂着多种细菌的分离培养,经过划线接种,将细菌分散到固体培养基的表面,以获得单个菌落。
常用的平板划线接种法可分为以下两种:
(1)分区划线法
图2-4-1分区划线法
注意事项:
此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁、痰液等标本的细菌分离培养。
具体操作如下:
1)右手以持毛笔式握住接种环,垂直在火焰上烧灼灭菌。
2)待接种环冷却后,取葡萄球菌和大肠埃希菌混合液一环。
3)左手持平板培养基,左手拇指、食指开启平皿盖,右手将取菌后的接种环在平板培养基表面一角来回划线涂布,密而不重叠,接种环与培养基表面呈30~45o角度,作为第一区,约占平板总表面积的1/5。
划线时,以腕力在平板表面作轻快的滑动动作,不可用力太大,以免划破培养基表面,并注意无菌操作,防止空气中微生物的污染。
4)再次烧灼接种环,以杀灭接种环上剩余的细菌,待冷。
将平皿转动一定角度进行第2区划线,第2区划线与第1区划线开始相交2~3条,以后可不必相交。
约占平板表面积的1/4。
再灭菌接种环后用相同方法进行第3区、第4区划线。
5)种完毕,烧灼接种环,放回原处,平板底部做好标记(姓名、日期、标本名称等),倒置(平板底部向上)于37℃温箱中培养18~24h,观察结果(图2-4-1)。
①严格无菌操作:
操作时不能说话,不能离酒精灯太远,平皿盖不能开得太大,以免空气污染;
②划线时,力量要适中,切勿划破培养基表面;
③充分利用平板表面,但第四区不能与第一区划线相交。
(2)连续划线法
图2-4-2连续划线法
连续划线法又称平行划线法,此法多用于含菌量不多的标本或咽拭、棉拭的细菌分离培养。
具体操作如下:
1)将接种环在火焰上烧灼灭菌。
2)待接种环冷却后,以无菌操作取标本或少许菌液,涂布于培养基的1/5处,
3)然后在培养基表面连续左右划曲线,密而不重叠,并逐渐下移,将整个平板布满曲线。
4)接种完毕,烧灼接种环,放回原处。
平板底部做好标记(姓名、日期、标本名称等),平板底部向上于37℃温箱中培养18~24h,观察结果(图2-4-2)。
2、斜面培养基接种法:
图2-4-3斜面培养基接种法
主要用于纯培养、保存菌种及生化反应试验等。
通常是从平板培养物上调取某一单个菌落,移种至斜面培养基上。
(1)左手持平板培养基(或同时持菌种管和接种管,见图2-4-3),右手持接种环或接种针在火焰上烧灼灭菌,待冷后挑取单个菌落。
(2)左手换取待接种的斜面培养基,斜面部向上,以右手手掌与小指拔取并夹持试管塞,管口通过火焰灭菌。
(3)将取菌后的接种环(针)伸入斜面管内,先从斜面底部到顶部划一条直线,然后再从斜面底部由下而上做蛇形划线。
接种环(针)进出试管时,均不应触及试管口内壁。
(4)将试管口和接种环(针)灭菌后放好,塞上试管塞。
(5)注明标记,置37℃温箱培养18~24h后观察生长情况。
3、液体培养基接种法:
主要用于增菌培养和生化反应试验。
(1)左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的肉汤管。
(2)接种环灭菌冷却后,分别从菌种管(大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌)挑取少量菌苔或菌落移种到肉汤管中。
在接近菌面上方的管壁上轻轻研磨,并沾取少量肉汤与之调和,使细菌混合于肉汤中。
(3)灭菌试管口和接种环,加塞、标记,置37℃温箱培养18~24h后观察生长结果。
大肠埃希菌可出现均匀混浊生长;链球菌可出现沉淀生长;枯草芽胞杆菌为表面生长,形成菌膜。
图2-4-4液体(左)及半固体(右)培养基接种法
4、半固体培养基接种法:
主要用于检查细菌的动力和保存菌种。
(1)同液体培养基接种法,左手握住菌种管与待接种的半固体培养基。
(2)右手持接种针灭菌冷却后,挑取接种管少量大肠埃希菌或痢疾志贺菌菌苔,垂直刺入半固体培养基的中央,深入管底至3/4处(不必穿至管底),随即沿原穿刺线退出。
(3)试管口灭菌后加塞,注明标记,置37℃温箱培养18~24h后观察结果(图2-4-4右)。
有鞭毛的细菌(如大肠埃希菌)能够沿穿刺线向四周扩散生长,为动力实验阳性;而无鞭毛的细菌(如痢疾志贺菌)只能够沿穿刺线生长,为动力实验阴性。
二细菌的培养技术
【材料】
1、器材:
温箱、磨口玻璃干燥器、厌氧培养箱、厌氧袋或厌氧罐、二氧化碳培养箱等。
2、试剂:
重碳酸钠、盐酸、焦性没食子酸等。
【方法】
常用的细菌培养方法可分为四类,即普通培养法、二氧化碳培养法、厌氧培养法和微需氧培养法。
1、普通培养法
用于无须特殊要求的需氧菌和兼性厌氧菌的培养。
是指需氧菌和兼性厌氧菌在有氧条件下的培养方法。
将已接种细菌的琼脂平板、斜面、半固体或液体培养基等,在空气中置于37℃温箱,培养18~24h,观察细菌的生长情况。
一般细菌培养
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