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圆二色光谱在研究蛋白结构中的应用
圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用
摘要:
圆二色光谱(CD)是研究手性分子结构的重要工具,最近几年来圆二色光谱在蛋白结构分析中应用愈来愈普遍。
本文综述了圆二色产生原理及与蛋白质结构关系并简单论述了圆二色光谱在研究蛋白结构中的应用案例。
关键词:
圆二色光谱;蛋白质;构象;
由于光学活性分子对左、右圆偏振光的吸收不同,使得左、右圆偏振光透事后变成椭圆偏振光,这种现象确实是圆二色性(circularDichroism,简称CD)。
历史上,圆二色性又称为光学活性,巴斯德在19世纪就发觉并研究了柠檬酸的光学活性。
传统的圆二色谱是指波长在200~400nm之间的吸收谱,20世纪70年代,由于“八区律”、“激子手性法”[1]等方式的发觉和进展,圆二色谱取得了普遍应用。
圆二色光谱是一种差光谱,是样品在左右旋偏振光照射下的吸收光谱差值。
由于生物大分子大体都含有手性的基团和结构,圆二色光谱能够帮忙测量和观看生物大分子的结构和构象转变,也可应用于研究DNA/RNA反映、酶动力学、光学活性物质纯度测量、药物定量分析;天然有机化学与立体有机化学、物理化学、生物化学与宏观大分子、金属络合物、聚合物化学等相关的科学研究。
蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子,它并非是以长链分子的状态存在,而是折叠成特定的三维结构。
因此能够用圆二色技术测定蛋白质分子结构。
目前,测定蛋白质分子构象的方式还有X-射线衍射,核磁共振技术及冷冻电子显微技术[2]等。
在
专门存储蛋白质和核酸分子结构的中,接近90%的蛋白质结构是用的方式测定的。
大约9%的已知蛋白结构是通过技术来测定的。
另外是最近几年来兴起的一种取得低分辨率(低于5)蛋白质结构的方式。
可是X-射线衍射技术关于分析结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质,适合的单晶培育限制了它的应用。
二维、多维核磁共振技术适用于较小分子量蛋白质构相分析且数据处置进程繁琐。
冷冻电子显微技术只能用于形成二维晶体的体系,且需要专门的冷冻平台。
相较而言,圆二色光谱是研究稀溶液中蛋白质构相的一种快速简便的方式。
另外,圆二色对构象转变灵敏,它可灵敏地检测一些反映引发的构象转变,专门适用于观测蛋白质的变性。
利用圆二色性研究蛋白结构的工作始于1962年,Holzawarth与Doty发表了利用圆二色技术测定多聚氨基酸和肌红蛋白构象。
1969年Greenfield应用圆二色光谱数据估量了蛋白质二级结构[3],以后有关CD光谱研究蛋白质结构的报导增多。
近几年来,圆二色技术取得了科学工作者愈来愈多的关注。
1.蛋白质的圆二色性原理
蛋白质一样有一级结构、二级结构、三级结构、四级结构几个要紧结构层次,有的还有结构域或超二级结构。
在蛋白质和多肽分子中,肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键是要紧的光活性生色基团,当平面圆偏振光通过时,这些生色基团对左右圆偏振光的吸收不同,造成偏振光矢量的振幅差,使得圆偏振光变成了椭圆偏振光,就产生了蛋白质的圆二色性[4]。
另外,有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性也有阻碍。
蛋白质的圆二色性要紧由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。
依照电子跃迁能级能量的大小,蛋白质的CD光谱分为三个波长范围[5]
(1)250nm以下的远紫外光谱区,圆二色性要紧由肽键的n-π*电子跃迁引发(酰胺键的吸收在190nm-250nm)
,这一波长范围的CD谱包括蛋白质主链构象的信息。
(2)250~300nm的近紫外光谱区[6],要紧由侧链芳香基团的π-π*电子跃迁引发,这一区域可给出“局域”侧链间的彼此作用。
(3)300-700nm的紫外可见光光谱区,要紧由蛋白质辅基等外在生色基团引发。
这一波段的CD谱对金属离子的氧化态、配位态及链与链间的彼此作用灵敏。
远紫外区的圆二色光谱反映了蛋白质或多肽的规那么二级结构中肽键排列的方向和能级跃迁情形,通过对谱带位置和吸收强弱的分析对照,就能够研究不同蛋白质或多肽的二级结构;近紫外区的圆二色光谱反映了芳香族氨基酸残基和二硫键在不对称环境中的圆二色性,要紧揭露蛋白质的三级结构信息,研究不对称微环境的转变和阻碍,对肽键在远紫外区的CD信号并非造成干扰,在研究中能够将这些信息作为光谱探针。
紫外-可见光谱要紧用于辅基的偶合分析[7]。
2.圆二色光谱研究蛋白质的二级结构与构象转变
远紫外区CD光谱要紧反映肽键的圆二色性。
在蛋白质或多肽的规那么二级结构中,肽键是高度有规律排列的,其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的割裂情形。
具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。
α一螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带,在222nm和208nm处表现出两个负的特点肩峰谱带;β-折叠的CD光谱在216nm有一负谱带,在185-200nm有一正谱带;β-转角那么在206nm周围有一正CD谱带;而左手螺旋P2构象在相应的位置有负的CD谱带。
单一波长经常使用于测定蛋白质或多肽由动力学或热力学引发的二级结构的转变[8]。
随着光学技术进展及同步加速器辐射圆二色(SRCD)光谱技术的进展,远紫外测量光谱能够展宽到190nm以下的真空远紫外区。
由于这一CD
光谱区域内,包括着更为丰硕的蛋白质二级结构信息,这一光谱区域的参考蛋白质的圆二色光谱及拟合运算方式也已成为研究热点。
3.蛋白质二级结构的含量的定量估量
初期的蛋白质或多肽的二级结构拟合计算方式中;要紧采纳多聚氨基酸为参考多肽。
成立α-螺旋、β-折叠及无规卷曲等二级结构参考CD光谱曲线,采纳单一波长法(208nm)计算出一螺旋含量后,然后假设不同的β-折叠含量值,并假设CD值是α-螺旋含量β-折叠含量和无规卷曲三者奉献值的加和,通过运算机算出不同波长的θ(λ),得出计算曲线。
找出与实验曲线最接近的曲线计算出各构象的含量。
现代的蛋白质CD拟合二级结构的算法主若是,采纳最小二乘法、单值分解及神经网络方式等算法,以待测蛋白质代替参考蛋白体系中结构相似的某一蛋白质,反复计算取代后的收敛性,从而计算拟合出未知待测蛋白质的二级结构组成[9,10]。
4.圆二色光谱法在研究膜蛋白中的应用
膜蛋白是最近几年来分子生物学研究的热点。
膜蛋白是一类具有晶体类似结构的镶嵌于细胞膜上的蛋白,到目前为止,仅有为数不多的膜蛋白结构取得确认.研究说明,膜蛋白紫外电子光谱跃迁受到周围环境介电常数的阻碍,其缘故可能是由于溶剂阻碍了电子由基态跃迁到激发态(n-π*,π-π*)的跃迁能量。
不同于溶液环境中的蛋白质,膜蛋白镶嵌于疏水的脂质环境当中,因此,膜蛋白紫外CD光谱可能跟溶液状态下的CD信号有所区别。
Wallace等[11]研究说明以现有的未包括膜蛋白的参考蛋白体系,采纳SELCON3、CONTIN及CDSTR等拟合运算程序预测具有富含α-螺旋及β-折叠的膜蛋白,其结果与溶液状态的蛋白CD光谱有不同,专门在190nm后尤其明显;而且溶液状态的CD
光谱拟合蛋白结构结果与由DSSP方式计算的膜蛋白晶体二级结构有不同。
因此,现有的溶液参考蛋白体系不适合于CD拟合预测膜蛋白二级结构,应该成立新的含有膜蛋白的参考蛋白体系。
5.圆二色光谱法用于低密度脂蛋白氧化的研究
氧化修饰低密度脂蛋白(nLDL)被以为是动脉硬化的致病关键因素,它的性能与其唯一的组成蛋白apoB-100的二级结构及构象紧密相关[12]。
最近几年来圆二色光谱因其操作简单,灵敏度高在研究低密度脂蛋白氧化方面引发科研工作者的普遍关注。
Alexander等[13]用远紫外CD检测溶解的apoB-100和nLDL,结果apoB-100中的α-螺旋和β-折叠均比nLDL高,而无规那么卷曲和β-转角那么下降,整体的二级结构无显著转变。
Brunelli等[14]在研究E2的抗氧化作历时发觉,oxLDL中蛋白质的二级结构缺失。
LDL中apoB-100的构象发生了转变,E2使apoB-100的二级结构增加,而且构象改变后的LDL对脂的过氧化修饰产生了抗击作用。
6.圆二色光谱研究三环唑与牛血清白蛋白的彼此作用
BSA溶液显示出了BSA中-螺旋结构的3个特点峰,192nm有1个正峰,208、222nm处有2个负峰,吸收峰的强度能够反映蛋白α-螺旋的含量[15]。
当慢慢增加三环唑的浓度时,圆二色谱图中BSA在222nm的峰强度均增加,说明疏水作用致使BSA的结构收缩,α-螺旋结构含量增加,证明三环唑与BSA彼此作用致使蛋白质多肽链的重排,蛋白质构象发生转变。
三环唑浓度越大,对BSA
的构象阻碍越大,色氨酸和酪氨酸芳杂环残基的袒露越多,同时由于疏水基团之间疏水作用,ππ和n-π*跃迁能量增大,使BSA的多肽链发生重排,形成新的构象。
7.圆二色光谱法研究氰根配位的辣根过氧化物酶(HRP)的热伸展进程
研究发觉氰基取代后,酶中血红素铁的自旋状态和配位状态都与天然态完全不同,氰基取代水分子成为血红素Fe(Ⅲ)的第六配体,这时血红素周围的氢键也会蒙受必然程度的破坏,从而使HRP的热稳固性急剧下降[16]。
CD光谱分析说明HRP-CN的热变性进程与天然HRP变性进程不同,它存在二级和三级结构同时部份破坏的伸展中间态(Ⅰ,)和完全伸展后蛋白质的聚集态(A)。
展望
圆二色是研究溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方式,远紫外CD数据能快速地计算出溶液中蛋白质的二级结构;近紫外CD光谱可灵敏地反映出芳香氨基酸残基、二硫键的微环境转变,包括着丰硕的蛋白质三级结构信息[2]。
随着现代分析仪器的飞速进展,高压液相色谱、停流技术、电化学及荧光等附加装置与CD光谱仪器联用技术的应用,CD已经普遍地用于了解蛋白质-配体的彼此作用,监测蛋白质分子在外界条件诱导下发生的结构转变,探讨蛋白质折叠、失活进程中的热力学与动力学等多方面的信息。
尽管紫外圆二色光谱预测蛋白质结构还存在着参考蛋白体系及计算算法有待进一步完善的地方,但随着人们对蛋白质CD明白得的深切及CD光谱技术的进一步进展,其必将在蛋白质研究领域中发挥加倍重要的作用。
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