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丙酮酸钠对糖尿病大鼠视网膜保护作用的分析
丙酮酸钠对糖尿病大鼠视网膜保护作用的分析
复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文
丙酮酸钠对糖尿病大鼠视网膜保护作用的研究
中文摘要
糖尿病视网膜病变(DiabeticRetinopathy,DR)是糖尿病常见微血管并发症。
随着糖尿病患者逐渐增多,发病人群逐渐年轻化,DR成为威胁人群视力的重要疾病。
但DR的发生机制尚未完全明确,缺乏有效的早期治疗手段。
近年丙酮酸(PyruvicAcid)作为体内糖代谢的枢纽物质,因其所具有的独特抗氧化损伤作用而被重视。
既往研究证明,丙酮酸钠(PymvateSodium,NaP蚋在治疗糖尿病相关白内障、缺血性心肌细胞损伤、缺血性中枢神经系统损伤(CentralNervousSystem,CNS)等与氧化损伤密切相关的疾病中已经取得较好的疗效。
因此可推测NaPyr对DR亦具有良好的保护作用。
本课题以链尿佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的大鼠糖尿病模型为研究对象,从生物化学、免疫荧光及细胞超微结构观察等方面来评价NaPyr对DR早期大鼠M.(iller细胞的保护效果。
目的在体研究NaPyr对STZ大鼠DR的保护作用。
方法用75mg/kg的STZ一次性腹腔注射建立STZ大鼠糖尿病模型,随机分为糖尿病
对照组、口服组和腹腔注射治疗组。
口服组于饮水中加入2%NaPyr,腹腔注射治疗组
隔天向腹腔注射250mg/kg剂量NaPyr灭菌平衡溶液1次,糖尿病对照组隔天向腹腔注射相同体积灭菌生理盐水1次。
分别于1个月、4个月、6个月处死后取视网膜以硫代巴比妥酸法(ThiobarbituricAcidTest,TBA)检测视网膜组织丙二醛(Malonic
Dialdehyde,MDA)的含量,以黄嘌呤氧化酶法(XanthineOxidaseTest,XODTest)测定超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)含量,免疫荧光法检测谷氨酰胺酶(GS)、胶质纤维酸性蛋白(OFAP)在视网膜上的表达情况及透射电镜观察视网膜的超微结构。
结果在氧化应激相关指标方面,成模1个月时,口服组和对照组MDA均上升,注射给药组MDA有所下降,具有极显著差异(P<0.001)。
成模4个月和6个月时,各组MDA均保持稳定,不具有显著差异(P>0.05)。
在成模1个月时,各组SOD不具有显著差异(P>0.05)。
而4个月时,口服组和注射组SOD比对照组有所升高,具有显著差异(P 6个月时,口服组和注射组SOD与对照组相比,不具有显著差异(P>O.05)。 在视网膜Mfiller细胞方面,无论是成模1个月或4个月时,口服与注射组与对照组相 比均未发现GS的染色阳性区域明显改变,而口服与注射组GFAP在1个月及4个月时期的染色阳性区域都较对照组小。 成模1个月时,对照组的Mfiller细胞与神经节细 ~4~ 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文 胞超微结构有轻度改变,口服与注射组好于对照组。 而成模4个月时,各组神经节细胞及MWler细胞超微结构均受到较重破坏,而口服组受到的破坏轻于对照组及注射 组。 结论NaPyr对DR早期的保护作用可能存在,晚期NaPyr的保护作用尚不确定,有待进一步研究。 【关键词】糖尿病视网膜病变;丙酮酸钠;免疫荧光;生物化学;超微结构中图分类号: R774.1 ”,’ 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文 ResearchofProtectiveEffectofPyruvateSodiumonDiabeticRetinopathyofRat Abstract DiabeticRetinopathy(DR)isacommoncomplicationofdiabetesmellitusandisoneofthesevereeyediseasesleadingtoblindnesswhichinvolvesmoreandmoreyoungerpatientsastheincidenceofthediseaseincreasingly.ButthemechanismsofDRremainunclearSOthatDRlackseffectivetherapyinearlystage.Recentlytheimportanceofpyruvatehasbeennoticedinglucosemetabolismbecauseofitsspecialantioxidativeeffects.PreviousresearcheshaveprovedthatpyruvatesodiumfNaeyr)haveobvioustherapeuticeffectsondiseasesrelatedtooxidativedamagesuchasdiabeticcataract,myocardialischemiaandischemiccentralnervoussystem.ItcallbeinferredthatNaPyrmayalsohaveeffectonDR.Ourstudyuseddiabeticratmodelevokedbyintraperitonealinjection、析tllstreptozotocinfSTZ).111eprotectiveeffectsofNaPyronearlystageDRrats’Mitllercellswereevaluatedbybiochemistry,immunofluorescenceandobservationofcellultrastructurebyusingelectronmicroscope. ObjectiveToinvestigateprotectiveeffectofNaPyrondiabeticretinopathy. MethodsTheSDratmodelofdiabeticretinopathyWasbuiltbyinjectionofSTZ (75mg/kg).Theratsweredividedintodiabeticcontrol,oralandinjectiongroups.Ratsinoralgroupwerefed诵nl2%NaPyr,whileratsininjectiongroupreceived250mg/kgNaPyrinsterilizedequilibriumsolutionweeklybyintraperitonealinjectioneveryotherday. Ratsindiabeticcontrolgroupreceivedthesamevolumeofsterilizedsalineeveryotherday. Ratsweresacrificedandthentheirretinaltissuesweretakenforbiochemistryexamination forMDAbythiobarbituricacidtestandSODbyxanthineoxidasetestrespectivelyafter1,4,6months.ExpressionanddistributionofGSandGFAPWasalsomeasuredbyimmunofluorescence.UltrastructureofretinaWasevaluatedbyelectronmicroscopy. ResultsOnemonthaftermodelswereestablished,thelevelofMDAwasmuchhigherincontrolandoralgroupsthanininjectiongroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001).ThereWasnodifferenceinMDAlevelsamongeachgroup(P>0.05)after4 ~6~ 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文 months.Onemonthafterthemodelswereestablished.thelevelofSODwasnodifferenceamongeachgroup(P>0.05).After4months,theSODlevelinoralandinjectiongroupswashigherthanincontrolgroup(P<0.05).After6months,thelevelofSODwasno differenceamongeachgroup(P>0.05).TheresearchaboutMOilercellsdisCoveredthat areaofstainingofGSremainedthesameamongeachgroups.ButareaofstainingofGFAPWassi鲥ficantlyreducedafter1monthand4monthsinoralandinjectiongroupsthandiabeticcontrolgroup.TheultrastructureofMOilercellsandganglioncellsinoralandinjectiongroupsWaslesschangedthancontrolgroupafter1month.After4months,the ultrastructureofMtillercellsandganglioncellsWasdestroyedineachgroup.ButtheultrastructureofMiillercellsandganglioncellsinoralgroupsWaslessdestroyedinoralgroupthanincontrolandinjectiongroups. ConclusionIntheearlyperiodofdiabeticretinopathy,NaPyrmaybeaneffectiveprotectivetherapy.Butwiththedevelopmentofthedisease,moreresearchesaboutNaPyrareneededtoproveit. 【Keywords】DiabeticRetinopathy;PyruvateSodium;Immunofluorescence: Biochemistry;Ultrastructure ~7~ 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院堕主堡塞.—— —-———__-———_●————-—————————————————————————————————————————————————————————一 英文缩写词 缩写词英文全名中文 DRDiabeticRetinopathy糖尿病视网膜病变 NaPyrPyruvateSodium丙酮酸钠 CNSCentralNervousSystem中枢神经系统 STZStreptozotocin链尿佐菌素 MDAMalomcDialdehyde丙二醛 TBAThiobarbituricAcidTest硫代巴比妥酸法 SODSuperoxideDismutase超氧化物歧化酶 XODXanthineOxidase黄嘌呤氧化酶法 AGEsAdvancedGlycosylationEndProducts晚期糖基化终末产物 GluGlutamate谷氨酸 NONitrogenmonoxide一氧化氮 DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸 PBPhosphateBuffer磷酸盐缓冲液TrisTris(HydroxymeⅡ1y1)Aminomethane三羟甲基氨基甲烷LSDtheLeastSignificantDifference最小显著差法PIPropidiumIodide碘化丙啶 NFLNerveFiberLayer神经纤维层 GCLGanglionCellLayer神经节细胞层 IPLInnerPlexiformLayer内丛状层 TCAcycleTricarboxylicAcidCycle三羧酸循环 MCTMonocarboxylateTransporter单羧酸转运体 NOSNitricOxideSynthase一氧化氮合成酶 ~3~ 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文 丙酮酸钠对糖尿病大鼠视网膜保护作用的研究 击譬士 翮『舌 糖尿病视网膜病变(DiabeticRetinopathy,DR)是糖尿病常见微血管并发症。 随着糖尿病患者逐渐增多,发病人群逐渐年轻化,DR成为威胁人群视力的重要疾病。 但DR的发生机制尚未完全明确,缺乏有效的早期治疗手段。 DR的发生主要是由于高血糖使视网膜微环境发生改变,导致多元醇途径代谢异常【l,21、蛋白激酶C的异常激活【3】、蛋白质的非酶糖基化及晚期糖基化终末产物(AdvancedGlycosylationEndProducts,AGEs)的堆积【4,引、己糖胺途径的增加、氧自由基的大量生成【6】等病理生理过程,最终使视网膜的屏障受损,有毒物质进入视网膜,进而引起视网膜结构崩溃。 在视网膜微环境的改变中,血管损伤和神经损伤都是重要的发病机制,但是越来越多的证据【7,8】反映,神经损伤的发生比血管损伤要早,可能具有更加重要的意义。 DR的神经损伤机制包括缺血缺氧引起的神经营养因子供给中断【9-12】、谷氨酸(Glutamate,Glu)的神经毒性作用【13,l4‘、一氧化氮(NitrogenMonoxide,NO)的病理生理 作用【15,161、Miiller细胞的氧化损伤[61等等。 最终引起的后果是神经胶质细胞病理性增 生、神经节细胞发生凋亡。 近年来,氧化损伤被认为是DR神经损伤机制中的重要环节,包括视网膜光感受 器、双极细胞、神经节细胞、Mailer细胞、血管内皮细胞和周细胞均受到过量氧自由基的攻击,致使细胞核内DNA(DeoxyribonucMcacid)及细胞浆内线粒体均受到不同程度的氧化损伤【6】。 针对这些损伤,很多新的抗氧化药物被开发出来,如美金刚胺【17】、法舒地尔【18】等。 它们属于外源性物质,通过阻断细胞内神经递质受体而阻止氧化应激 相关信号的转导,从而间接产生抗氧化作用,但是常常引起血压波动、精神紊乱等副作用【19,20】。 丙酮酸(Pyruvate)是葡萄糖酵解的产物,为连接有氧代谢和无氧代谢的枢纽物质,在机体糖代谢中占据着十分独特的地位。 研究发现【2l】,对1型糖尿病患者应用丙酮酸制剂能够获得很好的耐受性。 它不仅能够降低血糖,还能够起到抗氧化损伤的作用,作为小分子,能够通过血.视网膜屏障而发挥作用。 既往研究证明,丙酮酸钠(PyruvateSodium,NaPyr)在保护胰岛细胞避免锌中毒损伤【22l,预防和治疗糖尿病相关白内障[23-251、糖尿病性心肌细胞损伤[261、缺血性中枢神经系统(CentralNervousSystem,CNS)损伤【27。 291等与氧化损伤密切相关的疾病中已经取得一定的疗效。 那么,NaPyr对于DR究竟有没有保护作用? 如果有的话可能的保护机制有哪些? 通过哪些关键的细胞和结构来起作用? 在DR的哪些发展阶段保护效果比较明显? 采用哪种给药途径与剂 ~8~ 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文 量能够取得较满意的效果? 这些均为有待回答的重要问题。 本课题以大剂量链尿佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的大鼠糖尿病模型为研究 对象,用稳定的NaPyr水溶液【30J为丙酮酸制剂,从生物化学、免疫荧光及细胞超微结构观察等方面来评价NaPyr对DR早期大鼠Miiller细胞的保护效果。 MDA是膜脂过氧化的产物,SOD是机体抗氧自由基的重要酶类,MDA和SOD是细胞与组织氧化还原状态的重要指标,目前测定方法已成熟L31|。 GFAP和GS是DR和正常机体视网膜表达存在差异的蛋白【32】。 另外,电镜观察视网膜超微结构是细胞器氧化损伤情况直接观察的有力手段。 以下,以NaPyr对DR氧化应激的保护作用以及NaPyr对DR大鼠Mtillcr细胞的保护作用两方面展开论述本课题的研究成果。 ~9~ 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文 第一部分视网膜病变 目的 1.研究丙酮酸钠对糖尿病大鼠视网膜病变氧化应激相关指标的保护作用。 2.探索保护作用可能的机制。 材料 一、实验动物 6周龄成年健康Sprague—Dawley大鼠50只,雄性,由中国科学院上海实验动物中心提供,符合国家医用实验动物使用标准体重介于180.2009,饲养于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院实验动物部,保持饲料充足,温度适宜,12h明亮/12h黑暗循环。 二、主要仪器和试剂 仪器(试剂)提供单位 One.touch血糖计及试纸美国强生公司 STZ美国Sigma.Aldrich公司 丙酮酸钠(培养级)美国Amresco公司SOD试剂盒南京建成科技有限公司 MDA试剂盒南京建成科技有限公司721型可见光分光光度计复旦大学上海医学院生物化学系 低温高速离心机北京六一仪器厂 手动搅拌匀浆器上海思伯明仪器设备有限公司恒温水浴箱美国Polyscience公司 柠檬酸上海凌峰化学试剂有限公司 柠檬酸三钠上海凌峰化学试剂有限公司 Tris美国Amresco公司 盐酸氯胺酮注射液上海恒生化工有限公司PB一10酸度计德国Sartorius公司 EDTA.2Na美国mml'eSCO公司 无水乙醇江苏昆山花桥化工四厂 冰乙酸上海润捷化学试剂有限公司 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠上海申博化工有限公司 ~10~ 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文 O.9%氯化钠注射液中国大冢制药有限公司三、主要溶液的配制 柠檬酸钠缓冲液: 称取2.19柠檬酸加入100ml双蒸水中配成A液,再称取2.949柠檬酸三钠加入100ml双蒸水中配成B液,按1: 1混合两种溶液,然后用酸度计调节pH在4.2.4.5即为柠檬酸钠缓冲液。 1%STz.柠檬酸钠缓冲液: 注射前,快速避光称取相应的STZ,以1%的浓度溶于柠檬酸钠缓冲液中,30分钟内全部注射完毕。 PB缓冲液: 先配制0.2mol/L的NaH2P04: 称取NaH2P04·H2027.69加双蒸水至1000ml溶解,再配制0.2mol/L的Na2HP04.称取Na2HP04·7H2053.69,两者按19: 81混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pB),根据需要可配制不同浓度的PB缓冲液。 蔗糖溶液: 蔗糖209溶于0.1mol/L的PB中,再加0.1mol/1PB至100ml充分混合,4。 C保存为20%蔗糖溶液;以309蔗糖配制为30%蔗糖溶液。 匀浆介质: 配制1000mlpH=7.4,0.01mol/LHCl,0.0001mol/LEDTA.2Na,0.01mol/L蔗糖,O.8%氯化钠溶液。 称取Tris1.219,EDTA.2Na37.23mg,加双蒸水500ml,再用200mmol/L滴定至pH=7.4,然后加入蔗糖3.429,氯化钠89,加双蒸水至1000ml,予以高温高压消毒后4。 C保存备用。 方法 一、大鼠糖尿病模型复制及分组1.造模 将35只大鼠予以新鲜配制的I%STZ.柠檬酸盐缓冲液腹腔注射1次,STZ剂量75mg/kg体重,溶于0.03mol/1的柠檬酸盐缓冲液0.8ml中(pH--4.7),禁食12h后(不禁 水)后,各组鼠常规进水进食,室温饲养,以每只鼠的右眼为研究对象。 2分组及成模后标本的制备 3天后,各组鼠行尾静脉取血,取血后用one.touch血糖计测量血糖,35只鼠血糖全部高于250mg/d1,为制模成功,制模成功的糖尿病鼠随机分为腹腔给药组25只、口服给药组13只、糖尿病对照组12只,其中腹腔给药组隔天给予灭菌NaPyr水溶液250mg/kg体重腹腔注射1次,糖尿病对照组给予相同体积灭菌生理盐水腹腔注射1次。 口服给药组每天于饮水中加入2%NaPyr,各组常规进水进食。 每个月称量各组鼠的体重并记录,每个月取各组鼠尾静脉血测定血糖并记录。 于成模1个月和4个月时分别处死口服给药组、腹腔给药组各5只,糖尿病对照 组3只,6个月时分别处死口服给药组、腹腔给药组、糖尿病对照组各3只,快速剪 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院硕士论文 取右侧眼球,剪断视神经,准备分别进行MDA和SOD生化测定。 二、视网膜匀浆的制备及各生化指标的测定 I制备视网膜匀浆 沿赤道部剪开眼球,在解剖显微镜下小心分离视网膜,在0"C冰浴中的匀浆介质中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,放入5ml小烧杯内。 用移液管量取预冷的匀浆介质,体积总量为组织块重量的9倍,用移液管取总量2/3的匀浆介质于烧杯中,用眼科剪尽快剪碎组织块,在盛有冰水浴的手动搅拌匀浆器中匀浆,匀浆后用离心机2000r/min离心15min,留上清,弃下面沉淀,在Eppcndorf管中保存,为10%组织匀浆,根据后续步骤进一步稀释。 2测定组织蛋白含量应用考马斯亮蓝法测定组织蛋白含量。 将10%视网膜匀浆液取部分加匀浆介质按 1: 9的比例稀释为1%匀浆液,以0.5639/1蛋白标准液作为参照,空白管加O.05ml蒸馏水及3ml考马斯亮蓝显色剂,标准管加O.05ml蛋白标准液及3ml考马斯亮蓝显色剂,测试管加O.05ml1%视网膜匀浆液及3ml考马斯亮蓝显色剂,混匀静置10分钟,于595nm处,lcm光径,蒸馏水调零,测定各管的吸光度,以(测定管OD值.空白管OD值)/(标准管OD值.空白管OD值)×标准管浓度(矾)计算各管蛋白浓度。 3测定组织MDA含量MDA含量的测定应用硫代巴比妥酸(TBA)法。 以lOnmoFml四乙氧基丙烷作为标 准品对照,使用微量丙二醛试剂盒,标准管加入0.1ml标准品和O.1ml试剂一;标准 空白管加入O
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