AFFYMETRIX基因芯片操作流程.docx

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AFFYMETRIX基因芯片操作流程

AFFYMETRIX基因芯片操作流程

第一章真核靶片断制备

＜一＞RNA的抽提

一、哺乳动物细胞或组织RNA的抽提

1.总RNA

RNeasyTotalRNAIsolationkit成功抽提哺乳动物细胞总RNA.

RNA的来源，建议使用TRIzol抽提总RNA.

使用QIAGEN'哺乳动物组织作为

+

2.

QIAGEN'OligotexDirectmRNAkit,从总RNA中抽提mRNA.RNA的来源，应首先使用TRIzol纯化，再进行一个Poly（A）+mRNA分

Poly（A）mRNA

哺乳动物细胞使用

哺乳动物组织作为离步骤或使用kit.

二、RNA沉淀

1.总RNA

在用RNeasyTotalRNAIsolationkit分离或洗涤后没有必要沉淀总RNA.调整洗脱体

积以制备cDNA合成接近希望的RNA浓度。

注：

为获得足够量的标记cRNA用来评估和基因芯片表达探针杂交，AFFYMETRIX建议开

始合成cDNA的Poly（A）+mRNA最小浓度为0.02卩g/卩l时的最小量是0.2卩g,总RNA最小浓度为0.5卩g/卩l时的最小量是5卩g.这样有两个好处：

（1）有足够量在各步检查样品浓度和质量

（2）制备足够的cRNA用于杂交

在TRIzol分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法.

2.Poly（A）+mRNA

大多数Poly（A）+mRNA分离过程都会导致得到较稀浓的RNA，所以需要在cDNA合成前

浓缩mRNA.

3.沉淀步骤：

加1/10体积3MNaOAc,PH5.2,和2.5倍体积乙醇.

混匀，-20C放置最少1小时.

4C,＞12000Xg离心20分钟.

80%乙醇洗涤沉淀2次.

空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥.

DEPC处理水重新溶解沉淀.最合适的溶解体积由cDNA合成中需要的RNA的浓

度和量来决定.先阅读cDNA合成的过程来决定这一步的适合溶解体积.

测定

（1）

（2）

（3）

（4）

（5）

（6）

4.RNA

用分光光度计分析RNA浓度，在260nm1单位吸光度等于40卩g/mlRNA.

需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度

A260/A280应接近2.0为较纯的RNA（比值在1.9-2.1也可）

＜二＞由纯化的总RNA合成双链cDNA

AFFYMETRIX强烈建议HPLC纯化T7-（d7）24primer

一、第一链cDNA合成

开始RNA的量:

高质量RNA5.0卩g-40.0卩g

纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40卩g/mIRNA）,A260/A280应接近2.0，在1.8-2.1的范围内。

建议在检测前跑一个琼酯糖电泳测定RNA质量。

rRNA条带应

该比较清晰没有明显的托影。

RNA浓

cDNA合成前，DEPC处理水和逆转录的正确体积必须确定。

它由加到反应中的度和总体积决定。

表1.1第一链cDNA合成反应逆转录体积

总RNA（卩g）

SuperScriptnRT（卩l）,200U/卩l

5.0-8.0

1.0

8.1-16.0

2.0

16.1-24.0

3.0

24.1-32.0

4.0

32.1-40.0

5.0

RNA和SuperScriptnRT体积不要超过12卩l合成反应应在1.5ML离心管中进行（RNase-free）表1.2第一链cDNA合成成分

反应试剂

体积

反应中最后浓度或量

1:

Primer

Hybridization

70C放置10分钟稍微离心，放置冰上

DEPC水

到反应最后体积20

卩l

T7-（d7）24Primer

1卩l

100pmol

RNA

5.0-40g

5.0-40g

2:

温度调节

加到相应管子混合均匀

42C放置2分钟

5XFirststrandcDNAbuffer

4卩l

1X

0.1MDTT

2卩l

10mMDTT

10mMdNTPmix

1l

500Meach

3:

第一链合成

加到相应管子混合均匀

42C放置1小时

SuperScriptnRT（200U/卩l）

见表1.1

200U-1000U

总体积

20卩l

二、第二链cDNA合成

1.第一链反应放置冰上。

稍微离心甩下管壁试剂

2.在第一链合成的管中加入下列第二链反应试剂（见表

表1.3第二链cDNA合成成分

成分

体积

反应中最后浓度或量

DEPC处理水

91卩l

5XSecondstrandcDNAbuffer

30卩l

1X

10mMdNTPmix

3卩l

200Meach

10U/卩lE.coliDNAligase

1卩l

10U

10U/lE.coliDNApolymeraseI

4卩l

40U

2U/卩lE.coliRnaseH

1口l

2U

终体积

150卩l

3.

混匀。

稍微离心，16C放置2小时

4.

加21l

【10U】T4DNApolymerase

5.

16C放置

5分钟

6.

加101l

0.5MEDTA

7.

继续纯化

cDNA步骤，或-20C储存

＜三＞纯化双链cDNA

一、PhaseLockGels（PLG）酚/氯仿提取

1.>12000g离心PLG管20-30秒，离下管壁PLG

2.

3.

4.

5.

力口162卩l（等体积）的（25:

24:

1）酚：

氯仿：

异戊醇（10mMTris-HCLPH8.0,1mMEDTA饱和）到cDNA最后合成产物中（162卩l）,最后体积到324卩l。

混匀，稍微离心。

转移上液至PLG管

不要混合，PLG会混入溶液中。

》12000g离心2分钟

转移上层水相到一个新的1.5ML离心管中。

、乙醇沉淀

1.加0.5倍体积7.5MNH4OAc和2.5倍体积乙醇（-20C储存）到样品中，混匀

2.立即在室温下》12000g离心20分钟

3.去上清，0.5ML80%乙醇（-20C储存）洗涤沉淀

4.在室温下》12000g离心5分钟

5.小心去掉80%乙醇，80%乙醇再洗涤一次

6.空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥

7.12卩lRnase-free水重新溶解沉淀。

＜四＞生物素标记cRNA合成

参考BioArrayHighYieldRNATranscriptLabelingkit

表1.4cDNAinIVT（总RNA）

总RNA（卩g）

IVT中cDNA体积

5.0-8.0

10卩l

8.1-16.0

5卩l

16.1-24.0

3.3卩l

24.1-32.0

2.5卩l

32.1-40.0

2卩l

表1.5cDNA体外转录成分

成分

体积

纯化后的cDNA（含总RNA）

5卩l

水（Rnase-free）

17卩l

10XHYReagentbuffer

4卩l

10XBiotinLabeledRibonucleotides

4卩l

10XDTT

4卩l

10XRnaseInhibitorMix

4卩l

20XT7RNAPolymerase

2卩l

终体积

40卩l

37Q,4.5小时，600rpm振荡10秒/35分钟

＜五＞纯化和质控体外转录（IVT）产物

一、体外转录纯化

不要用酚-氯仿提取生物素标记RNA,生物素能导致部分RNA进入有机相，得到的量会减少。

保存部分没纯化的IVT产物凝焦电泳分析。

建议先纯化一半IVT产物，在纯化另一分前测定cRNA量。

如果样品在纯化过程中丢失，则可用保存的另一部分。

如果IVT产物量很高，RNA的量则会超出纯化能力。

那么纯化一半更好一点。

纯化后的cDNA的最小浓度是0.6卩gml。

建议的IVT纯化方法

（1）QIAGENRNeasyColumns（优先方法）

（2）CHROMASPIN-100（sizeexclusionspincolumns）+EtOH沉淀

QIAGENRNeasyColumns纯化

见试剂盒中参考手册

建议：

1•洗涤和洗脱之前将样品过柱两次。

2•洗脱RNA时加水到柱子后，静置一分钟，再离心。

CHROMASPIN-100S和EtOH沉淀法纯化

1.加RNase-free水（60卩l）到IVT反应是体系至100卩l。

2.50卩l（一半）样品装入柱子。

3.50卩lRNase-free水洗柱，在用流过柱子的样品洗柱。

二、乙醇沉淀（只适用于第二种纯化方法）

1.加0.5倍体积7.5MNH4OAc和2.5倍体积乙醇（-20C储存）到样品中，混匀。

2.-20C沉淀1小时-过夜。

3.4C,＞12000g离心30分钟。

4.0.5mL80%乙醇（-20C储存）洗涤沉淀2次。

空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥。

5.10-2011RNase-free水重新溶解沉淀。

三、cRNA质控

用分光光度计分析RNA浓度.

需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度

A260/A280应接近2.0为较纯的RNA（比值在1.9-2.1也可）

下面的计算公式确定调整cRNA的含量：

调整cRNA含量=RNAm-（totalRNAi）（y）

RNAm=IVT后测得cRNA量（ig）totalRNAi=^始总RNA的量（卩g）y=在IVT过程中使用的Cdna的倍数

四、凝胶电泳检测样品

产物有助于检测纯化过程丢失的范围。

0.1%的样品

加热到65C,5分钟

同时跑纯化和没有纯化的IVT

0.1%琼酯糖凝胶电泳分析

RNA和loadingdye混合，

＜六＞片断化cRNA

1•在新的1.5mLRNase-free离心管中按表1.6加入样品表1.6片断化反应

成分

体积

201gcRNA

1-321l

5XFragmentation

Buffer

81l

RNase-free水

到4011

2.

3.

4.

94C,35分钟。

然后放置冰上。

变性凝胶电泳，至少需要-20C储存样品

1.在新的1.5mLRNase-free离心管中按表2.1加入样品

2.使用前室温平衡探针

3.99C,5分钟

4.通过加样孔加入适量体积（见表

5.

6.

7.

8.

9.

表2.1杂交液

成分

Micro/Mini

Array

Midi

Array

Standard

Array

终浓度

片断化cRNA

5卩g

10卩g

15卩g

0.051g/1l

ControlOligonucleotide

B2（3nM）

1.7卩l

3.3卩l

5卩l

50pM

20XEukaryotic

HybridizationControls（bioB,bioC,bioD,cre）

5卩l

10卩l

15卩l

1.5,5,25,100pMrespectively

HerringSpermDNA

（10mg/ml）

1卩l

2卩l

3卩l

0.1mg/ml

AcetylatedBSA（50mg/ml）

1l

2卩l

3l

0.5mg/ml

2XHybridization

Buffer

50卩l

100卩l

150卩l

1X

水

至100卩l

至200卩l

至3001

终体积

100卩l

200卩l

3001l

20XEukaryoticHybridizationControls冻存，使用前65C,5分钟

2.2）1XHybridizationBuffer湿润芯片45C,60rpm预杂交芯片10分钟

步骤3处理过的样品45C,5分钟

最大速离心5分钟

从芯片中取出Buffer,加等体积处理好的杂交液

45C,60rpm杂交芯片16小时

表2.2

Array

杂交体积

总体积

Standard

2001l

2501l

Midi

1301l

1601l

Mini

801l

1001l

Micro

801l

1001l

<一>实验和洗涤工作站设置

一、进入ExperimentInformation

洗脱、染色、扫描芯片之前都必须先定义一个Experiment

二、准备洗涤工作站

基因芯片洗涤工作站400用来洗脱和染色探针阵列。

放置冰上或-80C长时间保存。

＜二＞洗脱和染色

1.杂交16小时后，从芯片中取出杂交液装入一个新的离心管,

2.WashBufferA充满芯片

3.配制下列溶液

表3.1SAPE液（使用前配制，4C储存）

成分

体积

终浓度

2XMESStainBuffer

600.0卩l

1X

50mg/mlacetyedBSA

48.0卩l

2mg/ml

1mg/mlStreptavidin-Phycoerythrin（SAPE）

12.0卩l

10g/ml

DI水

540.0卩l

总体积

1200卩l

表3.2抗体溶液

成分

体积

终浓度

2XMESStainBuffer

300.01l

1X

50mg/mlacetyedBSA

24.01l

2mg/ml

10mg/mlNormalGoatIgG

6.01l

0.1mg/ml

0.5mg/mlbiotinylatedantibody

3.61l

31g/ml

DI水

266.41l

总体积

6001l

4•洗涤工作站按表3.3工作

表3.3

标准格式

EukGE-WS2

Midi格式

Midi-euk2

Micro/Mini格式

Micro-1v1/Mini-euk2

PostHyb

Wash#1

10cyclesof2mixes/cyclewithWashBufferAat25C

10cyclesof2

mixes/cyclewithWashBufferAat30C

10cyclesof2

mixes/cyclewithWashBufferAat25C

PostHyb

Wash#2

4cyclesof15mixes/cyclewithWashBufferBat50C

6cyclesof15

mixes/cyclewithWashBufferBat50C

8cyclesof15

mixes/cyclewithWashBufferBat50C

Stain

Staintheprobearrayfor10minutesin

SAPEsolutionat25C

Staintheprobearrayfor5minutesinSAPE

solutionat35C

Staintheprobearrayfor10minutesinSAPEsolutionat25C

Post

Stain

Wash

10cyclesof4mixes/cyclewithWashBufferAat25C

10cyclesof4

mixes/cyclewithWashBufferAat30C

10cyclesof4

mixes/cyclewithWashBufferAat30C

2nd

Stain

Staintheprobearrayfor10minutesin

antibodysolutionat25C

Staintheprobearrayfor5minutesinantibodysolutionat35C

Staintheprobearrayfor10minutesinantibodysolutionat25C

3nd

Stain

Staintheprobearrayfor10minutesin

SAPEsolutionat25C

Staintheprobearrayfor5minutesinSAPE

solutionat35C

Staintheprobearrayfor10minutesinSAPEsolutionat25C

Final

Wash

15cyclesof4mixes/cyclewithWashBufferAat30CTheholdingtemperatureis25C

15cyclesof4

mixes/cyclewithWashBufferAat35C

Theholdingtemperatureis25C

15cyclesof4

mixes/cyclewithWashBufferAat35C

Theholdingtemperatureis25C

＜三＞扫描

＜四＞关闭洗涤工作站

附：

溶液配制

5XRNAFragmentationBuffer:

1MTris-acetate,PH8.1（冰醋酸调节PH）

MgOAc

KOAc

（200mMTris-acetate,PH8.1,500mMKOAc,150mMMgOAc）4.0ml

0.64g

0.98g

DEPC处理水至20ml

强烈搅拌，混合均匀

0.2m过滤

室温保存

12XMESStock:

（1.22MMES,0.89M[Na+]）

1000ml:

MESfreeacidmonohydrate

MESSodiumSalt

分子生物级水

70.4g

193.3g

800ml

混合，定溶至1000ml.PH在6.5-6.7之间

0.2卩m过滤

不灭菌，2-8C避光保存

2XHybridizationBuffer:

+

（1X:

100mMMES,1M[Na],20mMEDTA,0.01%Tween2）

50ml:

8.3ml

12XMESStock

17.7ml

5MNaCl

4.0ml

0.5MEDTA

0.1ml

10%Tween20

19.9ml水

2-8C避光保存

WashBufferA:

（6XSSPE,0.01%Tween20）

1000ml:

300ml

20XSSPE

1.0ml

10%Tween20

698ml

水

0.21m过滤

WashBufferB:

（100mMMES,0.1M[Na+],0.01%Tween20）

1000ml:

910.5ml

0.2m过滤

2-8C避光保存

2XStainBuffer:

（1X:

100mMMES,1M[Na+],0.05%Tween20）

250ml:

水

0.21m过滤

2-8C避光保存

10mg/mlGoatIgGStock:

溶解50mg在5mlPBS中4C保存