分析方法验证管理程序.docx

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分析方法验证管理程序

分析方法验证管理程序

ManagementProcedureofAnalyticalMethodValidation

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1目的

参照ICH指导文件Q2和各国药典，建立分析方法的验证程序。

2适用范围

企业新建或者修改后分析方法，包括滴定法、色谱法和其它定性和定量的理化分析方法，不适用于微生物限度方法，控制菌检查法，无菌方法，内毒素方法和颗粒度方法验证。

3定义和术语

3.1专属性（Specificity）：

是指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该分析方法在有共存物时对供试物准确而不受干扰的测定能力。

3.2准确度（Accuracy）：

是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。

一般以回收率（%）表示。

3.3精密度（Precision）：

是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得一系列结果之间的接近程度。

精密度一般用偏差、标准偏差（SD）或相对标准偏差（RSD）来表示。

精密度有3个评价水平：

重复性、中间精密度、重现性。

过去也用系统精密度、方法精密度、粗放度3个评价水平。

系统精密度（SystemPrecision）相当于现在系统适用性实验；方法精密度（MethodPrecision）相当于重复性（Repeatability）；粗放度（Ruggedness）相当于中间精密度（IntermediatePrecision）。

3.4重复性（Repeatability）：

在相同操作条件下，由一个分析人员在较短的时间连续测定所得结果的精密度称为重复性；如同一个人、在同一天、同一台仪器上进行的实验。

3.5中间精密度（IntermediatePrecision）：

在同一个实验室内，在不同时间、不同分析人员、用不同设备测定结果的精密度。

3.6重现性（Reproducibility）：

在不同实验室间，测定结果的精密度（也称为实验室间精密度）。

通常在分析方法药典标准化时才考虑。

3.7检测限（Limitofdetection，LOD）：

是在指定的分析方法条件下，样品中被测物能被检测出的最低量。

是一种限度试验的参数，用以表示测量方法在所述条件下对样品中供试物的最低检出量，但不需要准确定量，只需指出高于或低于该规定浓度即可。

3.8定量限（Limitofquantitation，LOQ）：

是在指定的分析方法条件下，样品中被测物能被定量检测出的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度，是一种含量测定的定量参数，杂质和降解产物的定量测定时应确定。

3.9线性（Linearity）：

指在给定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比的程度。

换句话说，就是试验结果（或测得的响应信号）与供试物浓度（或质量）的变化成线性关系。

3.10范围（Range）：

分析方法的范围是指能达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的样品中被测物上限和下限浓度（量）之间的区间。

3.11耐用性（Robustness）：

指在测定条件有较小变动时（但仍在正常允许使用范围内），测定结果不受影响的程度，也即证明方法的可靠性。

如溶液稳定性；流动相组成/pH，不同牌号色谱柱，柱温，流速等。

4责任

4.1分析中心：

确保根据此程序对新建方法和修订后的方法进行全部项目或者部分项目的验证。

4.2APIQC：

确保根据此程序对新建方法和修订后的方法进行全部项目或者部分项目的验证。

5EHS要求

N/A

6程序

6.1新开发方法的验证项目要求

6.1.1方法验证的要求

对于起始原料、中间体、原料药、制剂成品分析中所用到来源于非药典或国家标准的相关分析方法（例如：

微生物学的、生物学的、物理的、化学的），相对于药典有修改的分析方法，或用一个通用的方法来测一个新产品或新原料，均需进行分析方法验证，经验证后的分析方法可用于药品生产中间过程的控制、成品的检验、稳定性研究、以及工艺验证和清洗验证等。

药典的分析方法在收载前已经过验证，但是在各实验室运用前必须进行适应性确认。

6.1.2方法验证的项目包括鉴别试验，杂质定量检测，杂质限度检测，原料药或制剂中的有效成分含量测定，或者制剂的溶出度测定。

针对不同的分析方法，验证内容不同（见下表）。

特殊情况根据方法的特性和复杂程度而定。

分析方法类型

验证内容

鉴别试验

杂质检测

含量/效价/溶出度

定量检测

限度检测

准确度

－

+

－

+

精密度

重复性

－

+

－

+

中间精密度

－

+

（1）

－

+

（1）

专属性

（2）

+

+

+

+

检测限

－

+（3）

+

－

定量限

－

+

－

－

线性

－

+

－

+

范围

－

+

－

+

耐用性

－

+

－

+

注：

（1）已做有重现性（Reproducibility）验证的，不需验证中间精密度。

（2）如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。

（3）除特殊规定外，此项目需要做（内部要求，ICH指南未要求）。

6.2再验证的要求

6.2.1以下情况需要评估是否需再验证，例如，原料药工艺的更改可能引起杂质档案（杂质概况）的变化时；分析方法转移、原料药的来源发生显著变化、制剂产品配方变化、分析方法改变时、限度要求的更改，涉及到最初方法验证的范围不再适应的情况时；部分外部方法转移至本实验室时。

6.2.2再验证的要求取决于变化的性质和分析方法的类型（例如：

含量，限度测试等等），可限于那些受变化影响的项目，某些其它的更改也可能需要验证。

6.2.3分析方法在其生命周期应保持验证状态，这可通过适当的方法来确认，例如：

保证在整个有效期内分析程序有效。

可以被有效的程序证明，例如系统适应性结果、其它操作参数、控制表格的监控。

6.3验证管理

6.3.1验证前首先应进行方法的优化工作，基本上确定分析方法后再进行验证。

确认实验人员需经受相关培训（例如：

需使用到的仪器操作规程、需验证的分析方法、相关的理论知识）并理解这些内容。

在正式的验证开始前先做一些实验预摸索工作（需要具体到简单的线性，定量限，样品溶液的稳定性，加样回收率等），这些过程同样需要被记录下来。

对于色谱法的方法，建议的一些方法选择原则如下：

✓在能够保证准确检测的前提下，尽量选择易得到的色谱柱及检测仪器；

✓相关物质方法验证时，需要在DAD检测器进行波长选择，尽量选择所有杂质都有响应的检测波长；分离效果的选择应取所有已知杂质在该色谱条件下进样，确保适宜的分离度，如果不可获得已知杂质，可通过降解的方法得到，并考察峰纯度。

✓当测定含量时，样品的具体配制应选择称样量大于20mg，最好能大于50mg。

当称样量选择在20mg~50mg之间，通常是指不用再次转稀释的情况下。

如果样品配制需要两步时，则称样量应选择大于50mg。

✓气相验证能用顶空法尽量选用顶空法；标准溶液的配制过程中溶剂对照品的吸取量应尽量取整数以避免量取时的误差。

✓当杂质测定采用稀峰对照时，这个稀峰对照用标准品来稀释，不建议用样品溶液来稀释；

6.3.2基本上确定方法后（例如：

色谱柱品牌、样品浓度、溶液稳定性等），建立验证方案，方案中应详细规定具体的实验方法、可接受标准和各项目的实施步骤。

其编码规则见H3-SOP-01002“文件编码程序”，格式规定见H3-SOP-01001“文件的编制及管理程序”，一般由实验人员起草，方案经QC技术支持部审核，再经APIQC审核后，与药政有关的再经药政人员审核、质量负责人审核批准。

6.3.3方案批准后开始进行验证工作，验证须严格按照方案中规定的方法进行，不得擅改。

若与方案不一致，应进行偏差调查，对操作过程中出现的任何偏差应予以调查并记录，直至重新确定方案并由质量负责人批准。

6.3.4验证过程中的数据记录规则

对于最原始的实验数据记录（例如：

图谱的峰面积）应全部记录不能修约，用excel计算表处理中间计算结果时不能修约，例如计算RSD值时，含量或杂质的计算结果不应使用“ROUND”功能进行修约，应使用完整的数据计算，但在验证报告中输入的数据可以修约，一般杂质保留四位小数，含量保留两位小数，由于这种原因造成报告中数据计算值与excel表计算值显示稍有不同的，可加“*”号备注原因。

分离度、拖尾因子、校正因子、保留时间、信噪比、RSD等的输入至少保留一位小数，LOD，LOQ的浓度至少保留两位小数，线性相关系数：

保留至小数点后四位；线性中的浓度保留至少两位小数。

6.3.5实验人员必须对所有实验过程及时、准确记录，所有的实验数据及计算细节必须记录在原始记录中，并经第二位实验员复核。

复核的内容包括：

溶液配制是否正确、数据记录是否正确、计算过程及计算结果是否正确、是否按方案进行、每一个验证项目的验证过程和验证结果是否符合方案规定的标准、记录是否规范、验证项目是否完整、偏差是否进行了调查等信息。

6.3.6实验完成后，由实验人员起草验证报告。

验证报告的内容应包含所用的样品批号、仪器设备名称、试剂等信息；并在报告中每一个实验项目后对项目的结果进行评估，在结论部分最终对该验证做一个总结性陈述并给出建议的杂质报告限。

在报告中需将主要典型溶液的图谱列出。

第二实验员复核报告，复核的内容包括：

报告中的数据（包括计算结果、溶液配制等）与原始记录是否相符、是否按方案规定的相符、结论是否正确等。

6.3.7复核后上交经QC分析技术支持部、APIQC审核报告的完整性和正确性，最后经质量负责人或APIQA代表批准该验证报告生效。

6.4验证项目

6.4.1系统适用性试验

每个验证的实验前，均需要进行系统适用性试验，系统适用性试验符合要求后方可进行验证的实验，否则验证数据无效。

系统适应性要求一般按H3-SOP-72033“色谱进样程序”，或同各产品项下规定。

6.4.2选择性或专属性

是指该分析方法明确分辨被测物中可能存在的成分而不被干扰的能力。

1）鉴别试验

应该能够区别有可能存在的结构相近的化合物。

不含被测成分的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应。

2）含量和杂质检测

色谱法的专属性验证，应提供典型图谱，图中应并标明每个组分的位置，两相邻峰之间的分离度应符合要求。

同时通过峰的纯度检查（DAD、PDA）来证明被检物的色谱峰中只有单一组分。

选择适当的仪器、试剂（包括仪器型号、GC或HPLC色谱柱，以满足分析要求，流动相配比等）使原料药合成工艺中或发酵工艺可能存在的杂质（包括原料，中间体，前体及降解产物）必须与成品较好地分开，主峰与杂质峰的分离度以及各色谱纯度大于0.1%的杂质峰之间的分离度达到1.0以上，并确保成品峰中没有其他干扰物质峰存在。

✓杂质可获得的情况下：

对于含量方法，试样中可加入杂质（一般加入10倍杂质限度量）或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。

对于杂质检测方法，可向试样中加入一定量的杂质（一般加入杂质限度量）或辅料，考察杂质能否完全分离并不干扰样品中的其他组分。

✓杂质不可获得的情况下

可将含有杂质或降解物的样品进行测定，与另一个经验证的方法（例如，药典方法或其他已验证方法）来比较。

一般来说，应做样品的降解检测：

降解破坏条件至少应有HCI、NaOH、H2O2、光照、加热，对于有引湿性的样品,还需要做高湿实验。

降解幅度通常控制在5~20%之间。

对各降解条件下的溶液进行分析，对主峰纯度进行测定，需要不小于990（DAD检测器）。

3）气相色谱法顶空法在专属性中需考虑气相过程中一些干扰因素，比如热降解峰，空白溶剂中带来的干扰因素等。

常见的热降解峰有乙醛和甲醇。

6.4.3精密度：

精密度是指用分析方法测得的一组测量值彼此符合的程度。

精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差（变异系数）来表示。

重复性：

指短时间间隔内，在相同的操作条件下方法的精密度。

对于含量、相关物质、残留溶剂等定量测定项目，一般通过测定同一批样品6份，注意样品的选择，一般应尽量选用杂质明显的样品，如果样品检测值为未检出的，不利于评价检测精密度，应考虑在样品溶液中添加一定量标准品（一般液相方法，若能够获得的杂质需加入限度的量；气相方法，均需加入限度的量。

）再进行检测，考察其重复性。

接受标准：

根据样品检测浓度的不同，接受的标准也不同，除有特殊规定外，一般参照下表。

项目

检测值

接受标准

含量

>90%

RSD不超过2.0%

≤90%

RSD不超过5.0%

相关物质

LOQ至0.10%

两个实验室间平均杂质的结果不超过50%

>0.10至0.50%

两个实验室间平均杂质的结果不超过25%

>0.5%

两个实验室间平均杂质的结果不超过10%

残留溶剂

LOQ~1000ppm

RSD不超过25.0%

当检出值为>1000ppm

RSD不超过15.0%

以峰面积作为评价对象时

RSD不超过15.0%

中间精密度：

在同一个实验室内的操作条件变化（不同日期，不同检测人，不同的设备）下的精密度。

一般需要验证不同日期，不同检测人，不同的设备，不同柱下的方法精密度，但通常不必要对这些变化分别验证。

对单次的检测重复性计算6份检测值之间的RSD再分别计算平均值，计算平均值的RSD来评价中间精密度，接受标准与重复性中的描述相同。

若为添加杂质情况时中间精密度的计算，计算时应计算回收率的RSD值达上表中要求，且各杂质回收率达到80~120%。

重现性：

指不同实验室之间的精密度。

当分析方法被法定标准采用时，应进行重现性试验，即方法转移实验。

6.4.4准确度：

是指用该分析方法测得的测量值与真值接近的程度。

一般以回收率表示。

一个分析方法的准确性应建立在它的范围。

1）含量测定方法的准确度

✓原料药含量测定方法的准确度

a）检测已知浓度（如：

参比物质）的分析物；

b）与已确定准确度的第二个检测方法比较检测结果；

c）在确定精密度，线性和专属性后，推断出准确度。

✓制剂含量测定方法的准确度

a）检测加入已知量的被测物并与待测制剂组份相同的混合物；

b）如不可能得到制剂中的所有组份，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定或与另一个已建立准确度的方法比较测定结果。

c）在确定精确度，线性和专属性后，推断出准确度。

✓取检测浓度的80%，100%，120%，各配三份样品溶液，每份进样一次。

计算结果和真实值比较计算回收率应为98.0~102.0%，若真实值未知，可假定多次测量的平均值为真实值，可以以精密度平均值数据来评价。

2）杂质定量测定的准确度

✓可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行验证。

如不能得到杂质或降解物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典规定方法或经过验收率。

若验证的方法。

如不能测杂质或降解产物的相对响应因子，则可用原料药的响应因子。

✓应明确单个杂质或总杂质的含量表示方法，比如是重量比或者是面积百分比。

✓在规定范围内，至少高中低三个浓度至少9次测定结果进行评价（例如：

三个浓度，每个浓度各配制三个样品溶液，每个溶液进一针），同时做一份未加标准的样品，准确度应以样品加入量百分回收率表示，或者以平均值与真实值之间的差和置信区间来表示。

方法是在空白样品中，加入己知浓度的样品进行测定,要求浓度范围至少涵盖测定浓度的LOQ-120%。

✓接受标准：

如需计算RSD，参照精密度项目中的接受标准。

计算回收率时根据样品的检测浓度设立合适的接受标准，一般情况下，当加入量在LOQ时，回收率接受标准为50~150%，高于此浓度回收率接受标准80~120%。

✓回收率计算公式：

回收率%=检出的杂质的浓度/杂质的理论添加浓度

6.4.5线性

1）线性是指该分析方法在给定浓度范围内，测试结果与样品中被测物浓度直接呈成正比关系的程度。

线性关系的测定应在规定的浓度范围内进行。

可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样并制备一系列供试液的方法进行测定。

以测得的响应值作为被测物浓度函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。

在有些情况下，响应值先作数学转换，再进行线性回归计算。

回归曲线的斜率越接近于1.00，表明越接近线性。

2）线性关系的测定应在规定的范围内进行。

在规定含量测定浓度的70%-130%或50%-150%选择至少五个不同的浓度点。

经精密稀释或称量，至少制备5份供试液。

每个浓度测定1～3次（一般情况下进2次）。

以测得的响应信号（或平均值）对被测物浓度进行线性回归。

3）数据要求：

至少要列出相关系数，线性图和回归方程，截距百分比。

4）校正因子计算：

主峰和各杂质均做一条线性方程，得到y=bx+a,

将（主峰的方程斜率b）除以（杂质的线性方程斜率b），得到的值即为校正因子。

当校正因子在0.9以下，1.1以上保留2位考虑对该杂质的响应进行修正，即该杂质的峰响应乘上这个校正因子进行折算。

0.90~1.10修约1.0。

5）接受标准：

相关系数：

r或R2两种形式=0.99-1.00（一般情况下，常量最低要求：

>0.995；杂质、残留溶剂、清洗方法最低要求：

>0.98）

可用Excel软件或其它方式计算。

截距百分比：

截距不应明显地偏离零点。

常量不超过100%浓度峰面积的3%；杂质不超过100%杂质浓度峰面积的15%。

截距百分比=截距/100%主峰面积

6.4.6范围

1）范围是指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，该分析方法适用的供试物浓度的范围。

2）方法的分析范围应符合以下要求：

✓含量分析：

检测浓度的80%-120%；

✓含量均匀度：

检测浓度的70~130%，特殊剂型（如：

定量吸入剂）范围适当放大；

✓溶出度检测：

指定范围的±20%（下限的-20%至上限的+20%）；例如：

一个控释药物的规格为从1小时后的20%到24小时后90%，则验证范围应为0~110%的标示量；

✓杂质检测：

一般情况下，从定量限至规定限度的×200%。

如果此范围无法达到线性要求，至少应满足ICH的要求，即从杂质的报告限*~规定限度120%。

✓如果用一个试验同时进行含量测定和杂质分析，且仅使用100%的标准品，线性范围应从杂质的报告限至含量标准的120%。

如果在此范围内无法达到线性要求，可以按照1）和4）分段做线性分析。

✓杂质报告限一般原则：

Ø对于日服用量2g的药品，报告限为0.05%，对于日服用量2g的药品，报告限为0.03%。

Ø有些产品需要根据性质具体讨论

Ø液相法：

如果各杂质定量限接近，选最大的，但如果最大的超过0.05%，选第二大的来报告（不超过0.05%），最大的单独报告；如果定量限太小，小于0.02%，考虑报告限统一设置为0.02%。

如果各杂质定量限相差很远，把那些差别大的单独挑出来报告；如果各杂质的限度差别很大，也需要单独的报告，比如比卡鲁胺的氰化物和环氧化物。

气相法以各溶剂的定量限做为报告限。

6.4.7检测限

检测限是指样品中可以被该分析方法检测出的被测物的最低数量，不需定量。

有三种方法：

A、目测法；B、信噪比法（HPLC和GC用此法）；C、标准偏差和斜率法（UV、AA用此法）。

常用的是信噪比法。

1）目测法：

用于非仪器检测方法，但也可用于仪器检测方法。

通过样品中能被可靠地检测到的待测物的最低浓度来确定检测限。

2）标准偏差和斜率法：

检测限＝3.3×SD/S

SD：

响应值的标准差S：

校正曲线的斜率

斜率S可以从被分析物的校正曲线来估算，SD的值可由多种估算途径，如

✓根据空白的标准差：

通过几份空白样品的分析，然后计算其响应值的标准差，测出分析背景响应值的大小。

✓根据校正曲线：

通过对含有检测限范围内被分析物样品的分析来研究其标准曲线，回归线的剩余标准差或回归线的y轴截距标准差都可以作为标准差。

3）信噪比法：

只限于能显示基线噪音的检测方法。

即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

ICH指南要求信噪比为3：

1或2：

1时检测到被测物浓度为检测限。

通常做法是按信噪比大于2而小于5配制所有组分的样品溶液。

每个浓度配制一个样品溶液，每个样品进样二针，洗脱时间需覆盖整个样品中所有组分的流出。

平均噪声水平要以测定峰的半峰宽的20倍左右来计算平均噪声水平，然后再计算该组分的最小检测限。

信噪比计算公式（S/N）：

S/N=

2H

h

其中：

H——定量限溶液或检测限溶液中杂质D的峰高；

h——定量限溶液或检测限溶液中基线噪音

要求数据：

应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。

6.4.8定量限

定量限是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。

进行杂质和降解产物定量测定方法研究时，应确定定量限。

有三种方法：

A、目测法；B、信噪比法（HPLC和GC用此法）；C、标准偏差和斜率法（UV、AA用此法）。

常用的是信噪比法。

1）目测法：

用于非仪器检测方法，但也可用于仪器检测方法。

通过检测低已知浓度的样品，并根据检测结果符合一定的准确度与精密度要求的最低检出浓度来确定定量限。

2）标准偏差和斜率法：

定量限＝10×SD/S

SD：

响应的标准差

S：

校正曲线的斜率

斜率S可以从被分析物的校正曲线来估算，SD的值可由多种估算途径，如

✓根据空白的标准差：

通过几份空白样品的分析，然后计算其响应值的标准差，测出分析背景响应值的大小。

✓根据校正曲线：

通过对含有定量限范围内被分析物样品的分析来研究其标准曲线，回归线的剩余标准差或回归线的y轴截距标准差都可以作为标准差。

3）信噪比法：

信噪比法只限于能显示基线噪音的检测方法。

即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

ICH指南要求信噪比通常在10：

1时检测到的被测物浓度为定量限。

通常按检测限方法测定仪器的平均噪声,然后按信噪比等于10-15配制样品，连续进样六次，计算组分的定量限。

要求数据：

应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果和测定方法。

6.4.9耐用性

1）耐用性是指方法测定条件稍有变动时，测定结果不受影响的承受程度。

分析方法的耐用性是按下列不同条件进行试验，所得结果的重现性进行比较而确定。

2）液相色谱法中典型的变动因素：

流动相pH的变化；流动相比例的变化；不同柱子（同型号但不同批号与厂牌）；柱温；流速。

一般进样典型溶液为溶剂、系统适应性溶液、标准溶液、样品溶液等。

3）气相色谱法中典型的变化因素：

不同柱子（同型号但不同批号与厂牌）；柱温；流速。

4）操作：

对不同因素分别进行耐用性实验。

如需节省实验时间，也可考虑将不同实验条件进行随机组合（随机组合时应修改的多个条件对实验可能产生的影响为同向的，如果该耐用性试验的结果为超出，则应对这两种条件重新分别考察，以判断影响结果的具体因素。

如果结果符合说明同时改变的几个因素对实验均无明显影响）。

5）接受标准：

按其它项目项下的要求处理。

6）注意事项

试验过程应详细记录，包括色谱条件，样品、对照品、所用试剂的来源，含量，称量值,稀释过程，简要操