常规实验流程.docx
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常规实验流程.docx
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常规实验流程
常规实验流程
1.细胞总RNA的提取1、取出培养瓶,沿瓶壁小心倒掉培养基,用冷的PBS清洗2遍。
2、吸弃PBS,对于50ml培养瓶,每瓶加入0.9mlRNA裂解液;对于6孔板,则每孔加入0.6mlRNA裂解液。
3、用1ml移液器反复吹打40次,直至裂解液中无明显沉淀。
4、将各培养瓶中的裂解液分别收集至1.5mlEP管中,各管编号。
5、加入0.2ml氯仿(总体积的1/5,作用为沉淀提取RNA),于涡旋器上振荡15S,待管内液体充分乳化为乳白状后,静置3min。
6、4ºC离心15min,转速为12,000g。
7、从离心机中取出EP管,此时匀浆液分为三层:
无色的上清液(含RNA)、中间白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。
小心吸取上清液转移至另一新的EP管中(切勿吸出白色中间层),各管编号。
8、加入0.5ml异丙醇(与吸出的上清液等体积,溶解RNA),于涡旋器上充分混匀,静置10min。
9、4ºC离心10min,转速为12,000g。
10、小心吸弃上清,沿管壁缓慢加入75%的乙醇1ml(切勿触及沉淀),于涡旋器上充分振荡后,4ºC离心5min,转速为7,500g(g为重力加速度,低速离心时转速用rpm表示,高速离心时转速用g表示)。
11、弃乙醇(在不触及管底沉淀的前提下尽可能吸弃完全),室温干燥沉淀5min(不能完全干燥),加入25μlRNase-free水溶解沉淀。
12、RNA电泳:
取3µlRNA与1µlLoadingdye(是跑琼脂糖凝胶用来染DNA的染料,它是和loadingbuffer按一定的比例混合而成的.有的进口试剂buffer里已经加了loadingdye的,就不用加了.试剂说明书都有说明的.marker是直接加到凝胶里的.)充分混匀后,加入琼脂糖凝胶(1%)中,进行电泳分析。
28S与18S的相对亮度约为2:
1,若比值下降则说明RNA降解。
剩余的RNA于-80ºC冷冻保存。
2.cDNA逆转录分析1、逆转录分析的实验步骤详见图1。
2、逆转录后所得的cDNA保存于-20ºC,以待分析。
3、逆转录完毕,取2µlcDNA与1µl上样缓冲液混匀,进行琼脂糖(1%)电泳分析。
如各条带亮度相差过大,说明逆转录失败,则不能进行PCR分析。
3.RT-PCR反应实验1、PCR操作前,先将cDNA从冰箱取出,于室温下静置5min左右,然后以4,000rpm离心数分钟,再行下述操作。
RT-PCR反应体系的组成详见表1。
2、RT-PCR的反应操作均于冰盒中进行。
图1.cDNA逆转录反应操作步骤(注:
Oligdt与RnasefreeH2O混合后分装至各样品管,一般多配1个样品的量;dNTP、5×buffer与RNAinhibitor混合后分别加至各样品管,亦多配1个样本的量;AMVRtase需每个样品单加。
)95度灭活逆转录酶。
表1.RT-PCR扩增反应体系组成4.凝胶电泳实验1、准确称取0.3g琼脂糖,加入20mlTAE电泳缓冲液,加热溶解。
2、加入0.2μlGodview(其终浓度应为1%),充分混匀。
3、待凝胶液稍冷却后,缓慢倒入凝胶槽中。
4、将凝胶槽置于4ºC冰箱,待其自行冷却。
5、置凝胶槽于电泳仪中(凝胶需在电泳液的液面以下),加样孔朝向负极。
6、取5μlPCR扩增产物与1μl上样缓冲液:
于PE手套上充分混匀后加入各凝胶孔内。
7、电泳。
将电流设为150mA,以使电泳条件为恒压状态,电压设为80V,电泳时间视实际扩增的产物而定。
8、取出电泳完毕的胶条,进行凝胶成像分析。
Oligdt:
随机引物。
对于真核生物来说,RNA末端有一段保护用的PolyA序列,也就是一长串AAAAAAAAA的碱基,大概十多个碱基,所以我们会用oligdT引物来逆转录。
而原核类的没有PolyA结构,所以用随机引物来跟RNA碱基互补配对,随机引物就是包含了所有碱基组合的引物(如八聚体的随机引物有4的8次方中序列的引物在里面),RNA加热后变成单链的线性状,这时再降低温度退火(0度),引物就跟RNA配对结合了,然后在40多度的环境下由逆转录酶合成与RNA互补的另一条链,这样就得到cDNA了RNase是RNA酶。
RNase-free:
无RNA酶。
RnasefreeH2O:
无RNA酶水,即DEPC水。
Buffer:
:
缓冲液。
缓冲液的目的是给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。
目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)Tris是一种双极性离子缓冲液,20℃时其pKa值为8.3,△pKa值为-0.021/℃。
因此,20mmol/lTris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中,pH变化于6.8-7.8之间。
改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol/L,pH8.9,有时会增加产量。
附录2:
Westernblot操作规程
(一)细胞裂解及蛋白样品的定量处理1、将培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次后,用细胞刮刮取贴壁细胞,离心后弃上清。
2、加入适量裂解液(具体体积视所检测的目标蛋白而定),于冰上反复吹打2min(切忌将气泡带入离心管中)。
3、吹打完毕,将裂解产物全部转移至预冷的微量离心管中,置于冰上,每5min振荡一次,共孵育30min,以使其充分裂解。
4、4ºC离心12,000g,离心时间为15min。
5、每管各取10µl上清液,进行蛋白定量(每个样品重复2孔)。
6、将各管上清液全部转移至新预冷的微量离心管中,记录各管的裂解总体积;以蛋白浓度最低的管为标准,用裂解液将其余各管调整至与该管相同的浓度;将各管样品与5×上样缓冲液混合后,于沸水中煮10min,即为蛋白样本;最终的样品于-80ºC保存。
(二)组织裂解操作方法1、用灭菌的预冷的工具分离目的组织,尽量置于冰上以防蛋白酶水解。
2、将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中,加入液氮冻结组织于冰上均质研磨。
3、每约5mg加入约300μl预冷的裂解液,冰浴匀浆后置于4ºC摇动2小时,裂解液体积与组织样本量有适当比例,(最终的蛋白浓度至少达到0.1mg/ml,理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml)。
4、4ºC离心12,000rpm,20min,轻轻吸取上清,转移至新预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀。
(三)Westernblot操作规程1、封闭胶槽。
灌胶之前,先用胶条封闭胶槽底部,再用5ml注射器将0.5%琼脂糖沿胶槽边沿快速(避免琼脂糖凝固)注入封闭胶槽。
2、配胶。
浓缩胶的配制方案详见表1,分离胶的浓度选择详见表2,分离胶的配制方案详见表3。
配胶时最后加TEMED。
表1.浓缩胶配制方案表3.分离胶的配制方案3、分离胶的灌制。
用注射器沿倒胶槽边缘迅速注入分离胶,每块胶按5ml配制即可。
分离胶灌制完毕,于其上加入1ml去离子水,以防止胶面氧化。
为使电泳槽两侧胶面的电泳速度一致,两侧胶槽内的分离胶及水的体积应保持一致。
3、浓缩胶的灌制。
待分离胶凝固后(约50min),倒去胶面上层水,用滤纸吸干。
沿胶槽边缘迅速注入浓缩胶,每块胶按4ml配制即可。
然后,将梳子沿水平方向轻轻插入,防止气泡进入胶层。
4、蛋白样品准备。
取出蛋白样品,于沸水中煮10min。
煮好后瞬时离心,并置于37ºC水浴箱中备用。
5、1×电泳缓冲液配制。
去离子水400ml,5×SDS电泳缓冲液100ml。
6、将浓缩胶放入电泳槽中(若只电泳一块胶,则胶槽另一侧需垫一块玻璃板),将电泳液缓慢注入电泳槽,槽内电泳液需漫过内侧的玻板,外侧需漫过金属线。
加液完毕,轻轻拔掉胶条。
7.预电泳。
在每块胶上任选择一电泳孔,加入20μl左右上样缓冲液,在80V电压下进行电泳,直至上样缓冲液全部从分离胶中分离并进入电泳液中。
8、上样。
待浓缩胶凝固后上样(约30min)。
按照各管样品的总体积,算出其实际上样量(理论上样体积为30µl),加样前先用200µl加样器将样品轻轻混匀,上样速度要慢,否则样品易溢出加样孔。
每加一个样品,进样针需用去离子水反复冲洗数次,再用电泳缓冲液润洗数次,以免交叉污染。
蛋白Marker的上样量为4µl(不足30µl时,以1×上样缓冲液补足)。
上样完毕,在加样孔的两侧分别注入30µl1×上样缓冲液,以防止边缘效应。
进样针用完后,先用去离子水清洗数次,再用甲醇反复冲洗,最后用去离子水清洗晾干后保存。
9、电泳。
电泳采用恒压模式,先选择80V电压,待上样缓冲液运动至浓缩胶与分离胶分界线处时,将电压调整至100V。
待胶条中蛋白Marker的各条带彻底分离时,即可终止电泳。
10、切胶。
电泳结束,取出胶槽中的玻璃板,根据目的蛋白大小,对比蛋白marker的相应位置,切下所需胶条,同时在靠近正常对照组一侧的左上角切一小块作为标志,然后将胶条置于1×电转液中。
11、电转前的准备:
①电转膜的准备。
根据胶条的大小裁剪PVDF膜,并在膜的一角斜切以作为标志,然后将膜置于甲醇中浸泡2min后,迅速转移至电转液中,继续浸泡15min(PVDF是疏水性的,在转膜缓冲液里很难浸透,甲醇处理后使更容易浸润。
用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合)。
②大蛋白(>100kD)易在凝胶里形成聚集沉淀,故转膜时在电转液中加入终浓度为0.1%的SDS,以避免出现这种情况;甲醇易使SDS从蛋白上脱失,故对大蛋白分子转膜处理时,应将电转液中甲醇的浓度降至10%,以防止蛋白沉淀。
12、滤纸的准备。
根据所切胶条的大小裁剪滤纸(3张叠在一起),并将其浸于电转液中备用。
所剪滤纸的长及宽均较PVDF膜小2mm,以防短路。
13、转胶。
将夹子打开使黒的一面保持水平,其上垫一张海绵垫,用1ml枪头擀走里边的气泡;在海绵垫上垫三层滤纸,亦需擀走气泡;第3层放置胶条(胶条有切口的一侧位于左上角);第4层为膜(膜的切口与胶条的切口相对应),第5层为滤纸;第6层为海绵垫。
电转液中含甲醇,操作时需带PE手套。
14、转膜。
将夹子放入电转槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。
电转时会产热,应将电转槽放入盛有冰块的盆中。
转膜时间视目标蛋白的分子量而定,恒流转膜(250mA),各目标蛋白的转膜时间如下:
Bcl-2(28kD)、Bax(21kD)及Casepase-3(35/17/21kD)转膜时为50min;p38(38kD)、ERK(42/44kD)、SAPK(46/54kD)、β-actin(43kD)、及IκB(41kD)转膜时间为70min;Akt(60/56kD)转膜时间为90min;NF-κB(65kD)转膜时间为120min;PI-3(85kD)、VCAM-1(110kD)及ICAM-1(85-110kD)转膜时间为240min。
亦可进行半干转,条件如下:
0.6mA/cm2(Biorad公司电转仪),转膜时间视蛋白的分子量而定。
15、转膜完毕,回收电转液,将膜置于电转液中漂洗数分钟。
16、PBST配制。
250μlTween20加到500mlPBS中即可。
17、①5%脱脂奶粉配制:
1.5g奶粉加30mlPBST。
②5%BSA配制:
磷酸化蛋白应使用5%BSA封闭,因为脱脂奶粉含有酪蛋白,该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白,此时使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。
18、将膜置于5%的脱脂奶粉或BSA中,于摇床上封闭1h。
封闭完毕,以PBST漂洗1次。
19、一抗的准备。
将一抗贮存液按说明书提供的稀释倍数,用5%脱酯奶粉稀释成应用液。
20、一抗的孵育。
一抗孵育可按以下两种方法进行:
1)剪一PE指套;将PBST加入PE指套中,检查是否漏液;将膜加入指套中,再加入一抗,膜的正面朝下。
2)取一培养皿,培养皿的底预先铺一层石蜡,培养皿的盖预先铺一张浸有去离子水的滤纸;将膜置于培养皿中,正面朝上,将抗体滴于其上(约1ml左右)。
将加有一抗的膜在摇床上室温轻摇1h,冰箱里4ºC封闭过夜。
一抗的孵育时间取决于抗体与蛋白的亲和性及蛋白的含量丰度,建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。
尽可能选择低温孵育,如果在封闭液中孵育一抗过夜,应在4ºC进行,否则会产生污染而破坏蛋白(特别是磷酸基团)。
21、取出一抗,以PBST漂洗3次,每次5min。
22、按说明书提供的稀释倍数,用5%脱脂奶粉配制二抗。
二抗孵育的滴加步骤亦与一抗相类;将加有二抗的膜室温下于摇床上轻摇1h,振摇时注意正面朝下。
23、取出二抗,以PBST于摇床上漂洗3次,每次5min。
24、化学发光反应。
取出ECL发光试剂,吸取等体积的A液和B液配成反应液,充分混匀。
将膜从PBST中取出并用滤纸吸干,放入已用石蜡填平的培养皿中,再加入配好的发光反应液,放入图像采集仪内成像,根据图像的亮度调整曝光时间。
附录3:
细胞免疫组化操作规程1、PBS洗细胞3次,每次5min.2、4%多聚甲醛固定(以PBS溶解,溶解时需加热至60°C,同时加数滴1mol/l的NaOH),时间30min。
3、弃固定液,PBS洗3次,每次5min.4、0.4%H2O2孵育10min(9.5ml甲醇+0.35mlH2O2+0.15ml30%H2O2),以抑制过氧化物酶。
5、弃上清,PBS洗3次,每次5min.6、0.3%Triton(先配成3%的贮存液,临用时稀释。
以PBS溶解,溶解时需加热至37°C),室温孵育25min。
7、弃上清,PBS洗3次,每次5min.8、羊血清封闭10min.9、弃血清,加一抗,4°C过夜。
10、次日,37°C继续孵育1h后,PBS洗2次,每次5min.11、加二抗,37°C孵育1h.12、PBS洗2次,每次5min.13、加DAB显色,至背景为浅黄色。
14、弃上清,PBS洗3次,每次5min.15、苏木精染色5-10min.16、弃苏木精,水洗数次。
17、饱和碳酸锂染30S.18、弃碳酸锂,水洗数次。
19、盐酸酒精脱色,过一下即可。
20、弃上清,水洗数次。
21、微风吹干(一定要吹干,否则镜下非常模糊)。
22、梯度酒精透明,75%酒精30S;80%酒精30S;95%酒精1-2min;100%酒精2-3min.23、二甲苯透明5-10min,充分风干。
24、10%磷酸甘油封片(甘油与PBS按1:
9比例配制),镜检。
注:
酸酒精:
acidalcohol(0.5%concentratedHClin70%ethanol/water)
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