试验一紫外吸收光谱的绘制及有机化合物的鉴定.docx

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试验一紫外吸收光谱的绘制及有机化合物的鉴定

目录

实验室规则

实验一紫外吸收光谱的绘制及药品的鉴定

实验二荧光分光光度法测定维生素C

实验三气象色谱内标法分析白酒中的杂质

实验四反相高效液相色谱法分离芳烃类化合物

实验五红外吸收光谱的测定及结构分析

实验六原子吸收光谱测定水中镁

实验七几种生物样品中钙、铅含量的比较测定

实验八几种生物样品中硒含量的比较测定

附录一

附录二

附录三

实验一紫外吸收光谱的绘制及药品的鉴定

一、实验目的与要求

1．学习紫外吸收光谱的绘制方法，并利用吸收光谱对药品进行鉴定；

2．了解溶剂的性质对吸收光谱的影响，能根据需要正确选择溶剂；

3．学会UV–762紫外可见分光光度计的使用。

二、实验原理

吸收光谱——以不同波长的光依次通过一定浓度的被测物质，并分别测定每个波长的吸光度。

以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标。

所得到的曲线为吸收光谱。

紫外吸收光谱——指波段范围处于近紫外的吸收光谱。

分子吸收光谱的比较

紫外光谱

可见吸收光谱

红外吸收光谱

波段

远紫外10-200nm

近紫外200-400nm

400——800nm

0.75um—1000um

产生机理

分子吸收紫外辐射后

引起的外层电子跃迁。

电子光谱

分子吸收可见光后引起的外层电子跃迁。

电子光谱

分子吸收红外辐射后

引起的分子的振动、转动能级的跃迁

振—转光谱。

研究对象

不饱和有机物，特别是共轭体系有机物。

无机物

分子在振动过程中伴随偶极矩变化的化合物

（利用紫外光谱可对有机物进行鉴定及结构分析）。

紫外吸收光谱的特点：

图形比较简单、特征性不强，当不同的分子含有相同的发色团。

它们的吸收光谱的形状就大体相似，所以该法的应用有一定的局限性。

但紫外光谱对共轭体系的研究，如利用分子中共轭程度来确定未知物的结构有独特的优点。

所以紫外光谱是对有机物进行定性鉴定及结构分析的一种重要辅助手段。

本实验主要是利用紫外光谱进行下列两个工作：

1．定性分析：

所采用的方法一般是标准比较法：

测绘未知试样的紫外吸收光谱并同标准试样的光谱图进行比较。

当浓度和溶剂相同时，如果两者的图谱相同（曲线形状。

吸收峰数目、λmaa和εmaa）说明两者是同一化合物。

2．纯物质中杂质的检查：

一些在紫外光区无吸收的物质，如果其中有微量的对紫外光具有高吸收系数的杂质也可定量的检出。

如乙醇中杂质苯的检查，纯乙醇在200-400nm无吸收如果乙醇中含微量苯，则可测到：

200nm强吸收（ε=8000）

255nm弱吸收（ε=215。

群峰）。

3．溶剂性质对吸收光谱的影响：

溶剂的极性对化合物吸收峰的波长、强度、形状以及精细结构都有影响。

极性溶剂有助于n→π*跃迁向短波移动；

π→π*长；

并使谱带的精细结构完全消失，所以实验中分别以极性不同的正己烷、乙醇、水为溶剂，了解溶剂极性对吸收光谱的影响。

三、仪器与试剂

1．UV—762紫外—可见分光光度计（带盖石英比色皿）；

2．容量瓶若干；

3．水扬酸（ε=138）

4．无水乙醇

5．苯

6．正己烷

7．去离子水

四、实验步骤

1．仪器的基本结构（分四部分）：

（1）光源：

氢灯或氘灯。

光谱范围在180—400nm（氘灯中充以同位素代替氢，辐射强度比氢灯大4—5倍）；

（2）单色器：

作用是将连续光源分光，分离出所需的足够窄波段的光束；

（3）吸收池；

（4）检测器；蓝敏光电管。

2．仪器操作方法：

（1）打开外设电脑，进入桌面上的UV—8500图标，开仪器主机。

（等待灯预热及仪器自检约5分钟）。

计算机显示“就绪”；

（2）进入“波长扫描””OK”；

（3）设置参数；

（4）“启动”计算机自动描绘出吸收曲线并给出λmax、A

3．试样制备及测定：

（1）定性分析；领取未知试样的溶液，以去离子水为参比，用1cm石英比色皿，在220—360nm范围内测吸收光谱。

（2）乙醇中杂质苯的检出：

以纯乙醇为参比液，以含杂质乙醇为试液，在220—280nm范围测绘紫外吸收光谱。

（3）溶剂性质对吸收光谱的影响：

分别以正己烷、乙醇、水为溶剂配制水扬酸浓度为15mg·L-1溶液，以相应的溶剂作参比液，测绘各溶液在220—350nm的吸收光谱。

五、结果与讨论：

1．记录未知化合物的吸收光谱的条件（波段、A），确定峰值波长，并计算

εmax,与标准图谱进行比较，确定化合物名称。

水扬酸的参数：

C=15mg·L-1A=ε·Cmol.L·Lcm

λmax=231.5nmA=0.7504ε1=8420mol-1·cm-1·L

λmax=296.5nmA=0.4090ε2=4520mol-1·cm-1·L

2.记录乙醇试样的吸收光谱及实验条件，根据吸收光谱确定是否有苯吸收峰，峰值波长是多少？

纯乙醇CH3-CH2OH是饱和醇，在200—400nm无吸收

苯在紫外区有三个吸收带

π→π*180-184nmε=47000-60000（远紫外意义不大）

π→π*200-204nmε=8000（在远紫外末端也不常用）

π→π*230-270nmε=204（弱吸收的带π→π*这是苯环的精细结构或苯带，常用来识别芳香族化合物）。

3．记录不同溶剂的水扬酸的吸收光谱及实验条件，比较吸收峰的变化，了解溶剂的极性对吸收曲线的波长、强度的影响。

π→π*跃迁红移

溶剂极性增大为什么？

n→π*跃迁紫移

正己烷

乙醇

水

极性

π→π*

235.5nm

236nm

231.5nm

红移

n→π*

307.5nm

304.5nm

296.5nm

紫移

六、实验要点及注意事项

1．本实验所用试剂均为光谱纯或经提纯处理；

2．石英比色皿每换一种溶液或溶剂必须清洗干净，并用被测液荡洗三次。

3．注意仪器开关顺序：

先开外设计算机，再开仪器主机。

关时相反。

七、思考题

1.试样溶液浓度过大或过小，对测量有何影响？

应如何调整？

2.εmax值的大小与哪些因素有关？

实验二荧光分光光度法测定维生素C

一、实验目的

1.掌握荧光法测定食品中维生素C含量的方法。

2.了解分子荧光分析法的基本原理。

3.了解F-96型荧光分光光度计的使用方法。

二、实验原理

多数分子在常温下处在基态最低振动能级，产生荧光的原因是荧光物质的分子吸收了特征频率的光能后，由基态跃迁至较高能级的第一电子激发态或第二电子激发态，处于激发态的分子，通过无辐射去活，将多余的能量转移给其他分子或激发态分子内振动或转动能级后，回至第一激发态的最低振动能级，然后再以发射辐射的形式去活，跃迁回至基态各振动能级，发射出荧光。

荧光是物质吸收光的能量后产生的，因此任何荧光物质都具有两种光谱：

激发光谱和发射光谱。

维生素C又称抗坏血酸。

抗坏血酸在氧化剂存在下，被氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸与邻苯二胺作用生成荧光化合物，此荧光化合物的激发波长是350nm，荧光波长（即发射波长）为433nm，其荧光强度与抗坏血酸浓度成正比。

若样品中含丙酮酸，它也能与邻苯二胺生成一种荧光化合物，干扰样品中抗坏血酸的测定。

在样品中加入硼酸后，硼酸与脱氢抗坏血酸形成的螯合物不能与邻苯二胺生成荧光化合物，而硼酸与丙酮酸并不作用，丙酮酸仍可以发生上述反应。

因此，在测量时，取相同的样品两份，其中一份样品加入硼酸，测出的荧光强度作为背景的荧光读数。

由另一份样品不加硼酸，样品的荧光读数减去背景的荧光读数后，再与抗坏血酸标准样品的荧光读数相比较，即可计算出样品中抗坏血酸的含量。

三、仪器与试剂

1.仪器：

组织捣碎机，离心机，荧光分光光度计（F-2500）

2.试剂：

①百里酚蓝指示剂（麝香草酚蓝）：

称0.1g百里酚蓝，加0.02mol·L-1氢氧化钠溶液10.75mL溶解，用水稀释至200mL。

变色范围pH1.2（红）～2.8（黄）；

②乙酸钠溶液：

称取500g乙酸钠溶解并稀释至1L；

③硼酸——乙酸钠溶液：

称取硼酸9g，加入35mL乙酸钠溶液，用水稀释至1000mL（使用前配制）；

④邻苯二胺溶液：

称取20mg邻苯二胺盐酸盐溶于100mL水中（使用前配制）；

⑤偏磷酸——冰醋酸溶液：

称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水稀释至500mL过滤后，贮存于冰箱中；

⑥偏磷酸——冰醋酸——硫酸溶液：

称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用0.015mol·L-1硫酸稀释至500mL；

⑦抗坏血酸标准溶液：

准确称取0.500g抗坏血酸溶于偏磷酸——冰醋酸溶液中，定容至500mL容量瓶中，此标准溶液浓度为每毫升相当于1mg的抗坏血酸（每周新鲜配制）；吸取上述溶液5mL，再用偏磷酸——冰醋酸溶液定容至50mL，此溶液每毫升相当于0.1mg的抗坏血酸标准溶液（每天新鲜配制）；

⑧溴；

⑨活性碳：

取50g活性碳加入250mL10%盐酸，加热至沸，减压过滤，用蒸馏水冲洗活性炭，检查滤液中无铁离子为止，再于110～120℃烘干备用。

四、实验步骤

1.仪器操作条件

2.绘制标准曲线：

（1）将制备好的50mL标准溶液（含抗坏血酸0.1mg/mL）倒入三角瓶中，再往三角瓶中加入2～3滴溴（在通风橱内进行），摇匀变微黄色后，通空气将溴排净，使溶液恢复为无色，若用活性炭为氧化剂，加1～2g活性炭摇匀1分钟，过滤。

（2）取2只50mL容量瓶，各加入刚处理过的溶液1.0mL，其中一只容量瓶中再加入20mL乙酸钠溶液，用水定容至刻度，此液作为标准溶液。

另一只容量瓶中加入20mL硼酸——乙酸钠溶液，用水定容至刻度，此液作为标准空白溶液。

（3）取5支带塞的刻度试管，一支试管中加入2.0mL标准空白溶液，另4支试管中各吸0.5、1.0、1.5、2.0mL标准溶液，再分别用蒸馏水定容至3.0mL。

（4）避光反应：

在避光的环境中，迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液，加塞，振摇1～2分钟，于暗处放置35分钟。

（5）荧光测定：

选择上述最佳的仪器条件，记录标准溶液各浓度的荧光强度和标准空白溶液的荧光强度，标准溶液荧光强度减去标准空白溶液荧光强度计算相对荧光强度。

3.样品测定：

（1）样品处理：

称取均匀样品10g（视样品中抗坏血酸含量而定，其含量约在1mg左右），先取少量样品加入1滴百里酚蓝，若显红色（pH=1.2），即用偏磷酸——冰醋酸溶液定容至100mL，若显黄色（pH=2.8），即用偏磷酸——冰醋酸——硫酸溶液定容至100mL，定容后过滤备用。

（2）氧化处理：

将全部滤液转入三角瓶中加入1～2g活性炭振摇1～2分钟，过滤。

或在通风橱中加2～3滴溴，以下操作与绘制标准曲线同。

（3）取2只50mL容量瓶，各加入5.0mL经氧化处理的样液，再向其中一只加入20mL乙酸钠溶液，用水稀释至50mL作为样品溶液；另一只加入20mL硼酸——乙酸钠溶液，用水稀释至刻度，作为样品空白溶液。

（4）取2支带塞的刻度试管，1支试管中加2.0mL样品溶液为样液，另一根试管中加入2.0mL样品空白溶液作为空白，再分别用蒸馏水定容至3.0mL。

（5）避光加邻苯二胺，以下操作与绘制标准曲线（4）、（5）部分同样进行，得出样品的相对荧光强度。

五、结果与讨论

1.绘制相对荧光强度对抗坏血酸溶液浓度的标准曲线。

2.根据样品的相对荧光强度，从标准曲线上查出样品溶液中相对应的抗坏血酸浓度，再根据抗坏血酸浓度计算出样品中抗坏血酸含量。

六、注意事项

1.样品中如有泡沫，可滴加几滴乙醇、戊醇或辛醇消泡。

2.邻苯二胺溶液在空气中易氧化，颜